Instrument configuration for native N-linked oligosaccharide characterization by HPAE-PAD/MS

Význam tématu

Glykanová analýza představuje klíčový nástroj v biotechnologiích a farmaceutickém výzkumu pro charakterizaci N-vázaných oligosacharidů na glykoproteinech. Detailní profilování glykanových populací je nezbytné pro zajištění kvality, bezpečnosti a bioekvivalence bioterapeutik podle mezinárodních regulačních norem.

Cíle a přehled studie / článku

Technický popis se zaměřuje na instalaci a ověření workflow HPAE-PAD (vysokovýkonná aniontová výměnná chromatografie s pulzní amperometrií) spojené s vysokorozlišovacím Q Exactive™ Orbitrap™ MS za účelem bias-free charakterizace nativních N-glykanů odvozených z glykoproteinů. Metoda podporuje rychlé profilování 96 vzorků v řádu několika hodin.

Použitá instrumentace

• Thermo Scientific™ Dionex™ ICS-5000+ HPIC™ systém (dual pump, elektrochemický detektor ED, ERD 500 desalter)
• Thermo Scientific™ Dionex™ UltiMate™ WPS 300TBPI autosampler s termostatovaným modulem
• Thermo Scientific™ Q Exactive™ Hybrid Quadrupole-Orbitrap™ MS (negativní ESI, MS a data-dependent MS/MS)
• Dionex™ CarboPac™ PA200 guard a analytický column (3 × 250 mm)

Použitá metodika

• In-solution denaturace glykoproteinů (95 °C), enzymatická deglykozylace PNGase F (50 °C)
• Čištění uvolněných glykanů přes grafitovaný uhlík ve 96-jamkových filtrech
• HPAE separace s eluenty NaOH (100 mM) a sodného acetátu (100–250 mM) při 0,5 mL/min
• Post-column potlačení sodných iontů pomocí ERD 500 (elektrochemicky regenerovaný desalter)
• Negativní ionizační režim ESI-MS: m/z 400–2000, rozlišení 70 000 FWHM, AGC cílová hodnota 3×10⁶, DDA MS/MS (Top 10, NCE 30)

Hlavní výsledky a diskuse

• Analýza hu-AGP odhalila 53 unikátních nativních N-glykanů včetně izomerů s vysokou chromatografickou a hmotnostně-spektrometrickou rozlišitelností
• U monoklonálních protilátek (Humira®, Inflectra®) identifikováno 28–33 glykanů s průměrnou odchylkou hmotnosti <2 ppm
• Desalter ERD 500 vykazuje stabilní odstranění Na⁺ bez zhoršení rozlišení neutrálních glykanů (změna <10 %) a zároveň generuje acetonátové adduktní ionty podporující fragmentaci
• Porovnání PAD a MS záznamů potvrdilo zachování vynikajícího rozlišení a reprodukovatelnosti, MS/MS spektra obsahovala diagnostické glykozidické i mezikroužkové fragmenty
• Metoda umožňuje diferenciaci pozice sialylace a fucosylace, detekci vzácných modifikací (α-gal, N-glykolyl sialylace) a izobarních forem

Přínosy a praktické využití metody

• Bezderivativní workflow minimalizuje artefakty způsobené derivatizací (ztráta sialových zbytků, neúplné značení)
• Vysoká propustnost – 96 vzorků za cca 2 h včetně přípravy, čištění a analýzy
• Robustní data vhodná pro QC bioterapeutik a registraci podle ICH Q6B
• Široké uplatnění v charakterizaci monoklonálních protilátek, biosimilars, glykoproteinových biofarmak

Budoucí trendy a možnosti využití

• Plná automatizace přípravy a analýzy pro vyšší kapacitu a menší lidskou intervenci
• Integrace iontové mobility a dalších ortogonálních technik pro podrobné izomerní rozlišení
• Použití strojového učení a AI pro zrychlenou annotaci a kvantifikaci glykanů
• Rozšíření přístupu na O-glykanové analýzy, komplexní glykomické studie a biomarkerová hledání

Závěr

Navržené propojení HPAE-PAD s Orbitrap MS představuje vysoce selektivní, efektivní a reprodukovatelnou platformu pro detailní analýzu nativních N-glykanů bez nutnosti derivatizace. Metoda přináší klíčová data pro vývoj, výrobu a kontrolu kvality bioterapeutik.

Reference

1. ICH Q6B Guidelines (1999) – Harmonizované požadavky na charakterizaci glykanů
2. Thermo Scientific Technical Note 71: Eluent Preparation for HPAE-PAD
3. Thermo Scientific Technical Note 21: Optimal Settings for Pulsed Amperometric Detection of Carbohydrates
4. Thermo Scientific Electrochemical Detection User’s Compendium
5. Thermo Scientific Technical Note 110: Carbohydrate Determination with Disposable Au on PTFE Electrodes
6. Szabo Z. et al. Anal. Bioanal. Chem. 2017;409(12):3089–3101
7. Eavenson M. et al. Glycobiology 2015;25(1):66–73