O-glycan profiling using HPAE-PAD hyphenated with a high-resolution accurate mass (HRAM) mass spectrometer

Význam tématu

Glykování proteinů je klíčová post-translační modifikace ovlivňující řadu fyziologických a patologických procesů. Detailní profilování O-glykanů poskytuje cenné informace o složení a variabilitě glykosidických vazeb, což je důležité pro studium nemocí, jako je rakovina nebo autoimunitní onemocnění, a pro kontrolu kvality biotechnologicky vyráběných léčivých proteinů.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo ověřit a demonstrovat analytický workflow kombinující vysokovýkonnou aniontovou výměnnou chromatografii s pulzním amperometrickým detektorem (HPAE-PAD) a vysokorozlišovací Orbitrap MS pro profilování O-glykanů u čtyř modelových glykoproteinů: porciního mucinu typu III, hovězího fetuinu, hovězího fibrinogenu a hovězí thyreoglobulinu. Studie kladla důraz na bezderivátovou přípravu vzorku, účinné odstranění solí a vysokou spolehlivost identifikace pomocí tandemové MS.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky byly zpracovány reduktivní β-eliminací za použití 1 M NaOH s NaBH₄ při 50 °C po dobu 16 h. Uvolněné O-glykany byly čištěny na porézním grafitovaném uhlíkovém materiálu (HyperSep Hypercarb) a rekonstituovány do vody.

Separace:

• Dionex ICS-5000+ se systémem dvojitého čerpadla DP, kolona CarboPac PA300-4 µm (2×250 mm), teplota 30 °C.
• Eluční gradient od Nižšího podílu NaOH/sodné acetátu k vyšší koncentraci sodných solí.
• Post-column desalter Dionex ERD 500 pro odstranění sodných iontů.

Detekce:

• Pulsní amperometrie na zlaté elektrodě (TN21), kontinuální měření oxyaniontů glykanů.
• Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap MS s HESI-II ionizací v negativním módu. HCD fragmentace pro diagnostické ionty.

Softwarová analýza proběhla v Chromeleon CDS 7.2.9 a Xcalibur 4.1.31.9; strukturální anotace doplněna SimGlycan 5.0.

Hlavní výsledky a diskuse

Porciní mucin typu III obsahoval široké spektrum O-glykanů od malých neutralních přes sialylované až sulfátované struktury. Fetuin přinesl kombinaci známých sialylovaných N-glykánů a O-glykánů na bázi typu 1 jádra (mono- až disialylované tria- a tetra­sacharidy). U fibrinogenu dominovaly biantenní mono- až trisialylované O-glykany se směsí Neu5Ac a Neu5Gc, což koresponduje s nedávnými nálezy O-glykosylovaných míst v α- a β-řetězcích. U thyreoglobulinu byla poprvé experimentálně potvrzena přítomnost O-glykanu [Neu5Ac-Hex-HexNAc] a současně zaznamenáno bohaté zastoupení především vysokomannózových a komplexních N-glykánů.

Přínosy a praktické využití metody

• Bezderivátová příprava minimalizuje ztráty a chyby při značení.
• Vysoké rozlišení CarboPac PA300 umožňuje oddělení i neutrálních, sialylovaných a sulfátovaných glykanů jedním během.
• Síť post-column desaltingu chrání MS před kontaminací sodnými solemi.
• Kombinace PAD a Orbitrap MS zajišťuje spolehlivou kvantifikaci a strukturální informace z HCD fragmentace.
• Workflow je adaptovatelný pro O- i N-glykanový profil u širokého spektra glykoproteinů.

Budoucí trendy a možnosti využití

V budoucnu lze rozšířit aplikaci na komplexní biologické matrixy, klinické vzorky a bioprocesní kontrolu. Kombinace s iontovou mobilitou, pokročilými databázemi a AI-podporovanou interpretací dat zvýší automatizaci a hloubku strukturální elucidace. Nové kolony založené na alternativních materiálech by mohly nabídnout ještě lepší rozlišení isomerů.

Závěr

Prezentovaný HPAE-PAD/MS postup s využitím CarboPac PA300 kolony a Q Exactive HF MS umožňuje spolehlivou analýzu nativních O-glykanů s vysokou selektivitou a citlivostí. Workflow prokázalo robustní identifikaci konzervovaných i nových O-glykánových struktur u různých modelových glykoproteinů a nabízí široké možnosti pro biomedicínský výzkum i průmyslovou QC.

Reference

• Reily C., Stewart T.J., Renfrow M.B. et al. Glycosylation in health and disease. Nat Rev Nephrol. 2019;15:346–366.
• Montpetit M.L., Stocker P.J., Schwetz T.A. et al. Regulated and aberrant glycosylation modulate cardiac electrical signaling. PNAS USA. 2009;106:16517–16522.
• Hanisch F.-G. O-glycosylation of the mucin type. Biol Chem. 2001;382:143–149.
• Budnik B.A., Lee R.S., Steen J.A. Global methods for protein glycosylation analysis by mass spectrometry. Biochim Biophys Acta. 2006;1764(12):1870–1880.
• Bennett E.P. et al. Control of mucin-type O-glycosylation: classification of the polypeptide GalNAc-transferase gene family. Glycobiology. 2012;22:736–756.
• Szabo Z. et al. In-depth analyses of native N-linked glycans facilitated by HPAE-PAD coupled to MS. Anal Bioanal Chem. 2017;409(12):3089–3101.
• Thermo Fisher Scientific. Application Note AN73063: Improved profiling of sialylated N-linked glycans by IC-Orbitrap MS. 2020.
• Thermo Fisher Scientific. Technical Note TN72478: Instrument configuration for native N-linked oligosaccharide characterization by HPAE-PAD/MS. 2020.
• Thermo Fisher Scientific. Technical Note TN21: Optimal settings for pulsed amperometric detection. 2020.
• Thermo Fisher Scientific. Technical Note TN71: Eluent preparation for HPAE-PAD. 2020.
• Thermo Fisher Scientific. Application Note AN74042: Structural characterization of mucin O-linked glycans using HPAE-PAD-MS. 2020.
• Bergstrom K.S., Xia L. Mucin-type O-glycans and their roles in intestinal homeostasis. Glycobiology. 2013;23(9):1026–1037.
• Carr S.A., Huddleston M.J., Bean M.F. Selective identification of N- and O-linked oligosaccharides by LC-MS. Protein Sci. 1993;2(2):183–196.
• Lin Y.H., Franc V., Heck A.J.R. In-depth analysis of proteoforms of human and bovine serum and recombinant fetuin. J Proteome Res. 2018;17(8):2861–2869.
• Edge A.S., Spiro R.G. Presence of an O-glycosidically linked hexasaccharide in fetuin. J Biol Chem. 1987;262(33):16135–16141.
• Zauner G. et al. Protein glycosylation analysis by HILIC-LC-MS of glycopeptides. J Sep Sci. 2010;33:903–910.
• Zauner G. et al. Glycoproteomic analysis of human fibrinogen reveals novel O-glycosylation. J Proteome Res. 2012;11(12):5804–5814.
• Ronin C. et al. Regulation of thyroglobulin glycosylation: porcine thyroid glands vs culture. J Biol Chem. 1986;261(16):7287–7293.
• Spiro M.J. Presence of a glucuronic acid-containing unit in human thyroglobulin. J Biol Chem. 1977;252(15):5424–5430.