High-Sensitivity Analysis of Drugs in Ultra-Small Volumes Plasma Samples Using Micro-Flow LCMS/ MS

Význam tématu

Sledování koncentrací léků a jejich metabolitů v minimálních objemech biologických vzorků je klíčové pro preklinické farmakokinetické studie, kde je množství vzorku omezené. Zvýšená citlivost analýzy pomocí micro-flow LC-MS/MS umožňuje snížit počet zvířat i použitou látku, šetří náklady a podporuje etické přístupy.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo vyvinout a ověřit metodu micro-flow LC-MS/MS s trap-and-elute systémem pro přesnou kvantifikaci Verapamilu a Nor-Verapamilu v ultra-malých objemech plazmy (2 µL). Metoda má zajistit vysokou citlivost, dobrou přesnost a nízkou míru matrice.

Použitá metodika a instrumentace

• Vzorky: 2 µL plazmy zředěné 1:30 acetonitrilem s kyselinou mravenčí a izotopovým interním standardem.
• Příprava: precipitace, centrifugace, přenos 5 µL supernatantu na trapovací kolonu.
• Chromatografie: Shimadzu Nexera Mikros s trap-and-elute konfigurací; analytická kolona Shim-pack PLONAS Biphenyl 0,2×100 mm (2,7 µm), trapovací Shim-pack MCT LC8 0,3×5 mm (5 µm); průtok 4 µL/min; gradient 11 min; teplota 40 °C.
• Detekce: LCMS-8060 s micro-ESI, MRM režim (Verapamil 455→150 a 455→303, Nor-Verapamil 440,95→165 a 440,95→150, interní standard D6).

Hlavní výsledky a diskuse

Micro-flow analýza vedla k nárůstu signálu >4,5× pro Verapamil a >3,5× pro Nor-Verapamil (S/N >10×). Celkové recovery dosáhlo >97 %, kalibrační křivky v rozsahu 0,5–185 µg/L prokázaly přesnost 85–115 % a limit kvantifikace 0,5 µg/L. Chromatogramy vykazovaly vysokou selektivitu a opakovatelnost.

Přínosy a praktické využití metody

• Minimalizace objemu plazmy na 2 µL a snížení počtu zvířecích modelů.
• Vhodnost pro preklinické PK studie s omezenými vzorky a nákladově náročné materiály.
• Univerzální aplikace pro další farmaceutické a biomarkerové analýzy.
• Podpora principů 3R (Replacement, Reduction, Refinement) v mikro-samplingu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozvoj miniaturizovaných odběrů a automatizovaného micro-samplingového vybavení umožní nasazení metody v klinických mikroobjemech, sledování biomarkerů in vivo a integraci s HRMS pro komplexní spektrální analýzu.

Závěr

Micro-flow LC-MS/MS s trap-and-elute uspořádáním prokázala vysokou citlivost, přesnost a spolehlivost při analýze Verapamilu a Nor-Verapamilu v ultra-malých objemech plazmy, čímž nabízí výrazné přínosy pro preklinický výzkum.

Reference

• [1] Rapid Commun. Mass Spectrom. 2014, 28, 1293–1302