Microfow LC-MS/MS analysis of monoclonal antibody in human plasma at ng/mL level with nSMOL proteolysis

Význam tématu

Analýza terapeutických monoklonálních protilátek v plazmě lidské krve s nízkými koncentracemi na úrovni ng/ml je klíčová pro urychlení vývoje biologických léčiv. Metoda LC-MS MS nabízí vysokou specificitu díky kvantifikaci peptidů CDR, přináší širší dynamický rozsah a eliminuje potřebu vývoje nových protilátek pro detekci.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo vyvinout citlivou mikroprůtokovou LC-MS MS metodu pro stanovení trastuzumabu v lidské plazmě na úrovni jednotek ng/ml. Studie kombinuje technologii nSMOL proteolýzy se systémem Nexera Mikros, aby se dosáhlo téměř desetinásobného zlepšení citlivosti oproti předchozím semi mikroprůtokovým konfiguracím.

Použitá metodika a instrumentace

• nSMOL proteolýza pro selektivní štěpení Fab fragmentu protilátky
• LC systém Nexera Mikros s mikro až semi mikro průtokem 1-500 μl/min
• Analytický sloupec Shim-Pack MC C18 o průměru 0.175 mm a délce 50 mm
• Trap sloupec CERI L column2 Micro o průměru 0.3 mm
• Systém UF-Link pro minimální post column mrtvý objem
• MS detektor LCMS 8060 s mikro ESI zdrojem
• Gradientní eluce s použitím kyseliny mravenčí ve vodě a acetonitrilu

Hlavní výsledky a diskuse

Kalibrační křivka pro trastuzumab v plazmě byla lineární v rozmezí 7.6 ng/ml až 62.5 μg/ml s koeficientem korelace > 0.9998. Limit kvantifikace dosáhl 7.6 ng/ml, což představuje zlepšení citlivosti přibližně o řád oproti dřívější metodě. Opakovatelnost mezianalytických měření splnila kritéria RSD < 20 % pro LLOQ a < 15 % pro ostatní QC úrovně. Zlepšení citlivosti je přisuzováno sníženému průtoku pro optimalizaci ionizace a minimalizaci mrtvého objemu díky UF-Link.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlý vývoj metody do jednoho týdne oproti měsícům u ligand binding assay
• Vysoká specifičnost a široký dynamický rozsah bez potřeby selekčních protilátek
• Rutinní provoz bez rizika ucpávání díky standardním spojům
• Potenciál pro multiplexní stanovení více protilátek současně

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se, že podobný nárůst citlivosti lze dosáhnout u dalších signature peptidů terapeutických mAb. Integrace mikroprůtokových LC systémů s nSMOL proteolýzou by mohla vést k plně automatizovaným platformám pro klinické a preklinické studie, včetně real time monitoringu farmakokinetiky.

Závěr

Kombinace nSMOL proteolýzy a Nexera Mikros systému umožňuje kvantifikaci trastuzumabu na úrovni jednotek ng/ml v běžné laboratorní praxi. Tato přístupná a robustní metoda zásadním způsobem zkracuje R&D workflow a může být aplikována na široké spektrum monoklonálních protilátek.

Reference

1. Iwamoto N et al Analyst 2014 139 3 576 580
2. Iwamoto N et al Anal Methods 2015 21 9177 9183
3. Iwamoto N et al Drug Metab Pharmacokinet 2016 31 1 46 50
4. Iwamoto N et al J Chromatogr B 2016 1023 24 9 16
5. Iwamoto N et al Biol Pharm Bull 2016 39 7 1187 1194
6. Iwamoto N et al Bioanalysis 2016 8 10 1009 1020
7. Iwamoto N et al Clin Pharmacol Biopharm 2016 5 4
8. Iwamoto N et al J Pharm Biomed Anal 2017 145 33 39