Robust and Reproducible Protein Quantification in Plasma using the Evosep One and the Agilent 6495 Triple Quadrupole LC/MS

Význam tématu

Proteinová kvantifikace v lidské plazmě je zásadní pro ověřování biomarkerů, monitorování patologických stavů a vývoj cílených léků. Metody založené na více-reakčním monitoringu (MRM) spojené s nanoflow LC/MS nabízejí vysokou citlivost i v komplexních biologických matricích, avšak tradiční nanoflow systémy trpí nízkou robustností a náročnou údržbou. Kombinace Evosep One a Agilent 6495 triple kvadrupólu s nanosprayi přináší potenciál pro rychlou, reprodukovatelnou a vysoce výkonnou kvantifikaci bílkovin ve vysokopro­tokových studiích.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo ověřit robustnost, reprodukovatelnost a analytickou citlivost MRM metody pro kvantifikaci peptidů v lidské plazmě během dlouhodobého provozu. Studie sledovala stabilitu retence a MS signálu v průběhu 574 po sobě jdoucích injekcí během 12 dnů a porovnala limity detekce (LOD) a kvantifikace (LLOQ) před a po tomto robustnostním testu.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky: Trypsinizovaná lidská plazma obohacená 33 páry těžkých (SIS) a endogenních peptidů.
Instrumentace:

• Evosep One LC systém se spotřebními Evotipy a předem naprogramovanou 21minutovou analýzou (60 vzorků/den).
• Analytický column Pepsep 100 μm×8 cm, C18 3 μm, průtok 1 μL/min.
• Agilent 6495 triple kvadrupólový hmotový spektrometr v dMRM režimu s nanosprayi (model G1992A).

Data zpracování: Quantitation v Agilent MassHunter a Skyline software.

Hlavní výsledky a diskuse

Robustnost:

• 574 injekcí bez čištění nebo ladění přístrojů během 12 dnů.
• Median RSD retence u 33 p ěrů peptidů 8,5 %, 93,9 % pod 16 % RSD.
• U vybraných 4 peptidů RSD oblasti vrcholu 6–7,9 %, retence 0,59–1,04 % (n=574).

Citlivost:

• LOD 4 amol na kolonu, LLOQ 10 amol na kolonu v komplexní matrici.
• Lineární oblast 4 amol – 100 fmol, R2 před testem 0,9987, po testu 0,9998.
• Preciznost a přesnost 5 replik na všech koncentracích do 15 % RSD a 80–120 % přesnosti.

Přínosy a praktické využití metody

Platforma umožňuje rychlou a vysoce reprodukovatelnou kvantifikaci nízce až středně abundantních proteinů v plazmě bez časté údržby. Vhodná pro klinické verifikační studie, biofarmaceutický vývoj a rutina QA/QC v průmyslové analytice.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozvoj plně automatizovaných high-throughput workflow pro proteogenomiku, rozšíření multiplexovaných MRM panelů i aplikace ve screeningových studiích u velkých kohort. Integrace s AI nástroji pro pokročilou analýzu dat otevře nové možnosti v personalizované medicíně.

Závěr

Demonstrace vysoké robustnosti a citlivosti Evosep One & Agilent 6495 LC/MS platformy potvrdila její vhodnost pro dlouhodobé multi-sample studie kvantifikace plazmatických proteinů. Stabilní retence, nízké RSD a nízké LOD/LLOQ podtrhují potenciál pro rutinní aplikace v proteomice a klinickém výzkumu.

Reference

1. The Agilent 6495 Triple Quadrupole LC/MS: Peptide Quantitation Performance. AGILENT publ. 5991-6898EN, 2016.
2. Jet Stream Proteomics for Sensitive and Robust Standard Flow LC/MS. AGILENT publ. 5991-5687EN, 2015.
3. Bache N. et al. A Novel LC System Embeds Analytes in Pre-formed Gradients for Rapid, Ultra-robust Proteomics. Mol. Cell Proteomics 2018, 17(11), 2284–2296.