Untargeted Metabolomics Analysis of Ethanol Exposure in Liver Using LC/QTOF

Význam tématu

Metabolomika umožňuje komplexní posouzení biochemických změn v tkáních při expozici xenobiotikům, jako je ethanol. Analýza změn v játrech má klíčový význam pro pochopení mechanismů alkoholické hepatotoxicity, identifikaci biomarkerů poškození a pro vývoj intervenčních strategií. Použití vysokorozlišovací LC/QTOF se schopností rychlého skenování MS/MS (DIA) poskytuje široký a nezaujatý přístup k zachycení metabolitů a lipidů s vysokou citlivostí a reprodukovatelností.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem práce bylo demonstrovat end-to-end workflow pro untargeted metabolomiku založenou na vysokorozlišovacím LC/QTOF (použitelné na LCMS-9030 a LCMS-9050) a aplikovat jej na studium metabolických změn v jaterních tkáních myší vystavených dietnímu ethanolu. Studie porovnává profily extraktů jater od 8 ošetřených a 8 kontrolních zvířat po 11 dnech expozice a identifikuje signifikantní metabolity a lipidy, které korelují s intoxikací ethanolem.

Použitá metodika

Vzorky:

• Jaterní tkáně myší (C57BL/6) extrahovány v poměru tkaně/rozpouštědla 1,3 mg/µL v směsi methanol:isopropanol:voda (3:3:1, v/v/v).
• Supernatanty byly vysušeny a rekonstituovány v methanolu, finální ředění do 1:20 před analýzou.

Chromatografie a MS akvizice:

• UHPLC: Nexera X2 se C18 reverzní fází (2.1 × 100 mm, 1.7 µm), teplota kolony 50 °C, průtok 0.4 mL/min, injekce 0.5 µL, autosampler 4 °C.
• Mobilní fáze: A = voda + 0.1 % kyseliny formiové; B = acetonitril + 0.1 % kyseliny formiové; gradient od 2 % B k 90–100 % B podle uvedeného profilu (celkem ~135 min včetně reequilibrace).
• MS: LCMS-9030 QTOF v pozitivním a negativním ESI; TOF-MS m/z 100–1000; DIA-MS/MS 45 splitů m/z 40–1000 s izolačním oknem 20 Da a collision energy spread 5–55 V; celkový cyklus 1 s.

Kvalita dat a QC:

• QC vzorky připravené jako pool kombinací všech vzorků podle doporučení mQACC pro monitorování stability akvizice.
• Filtrování funkcí: RSD v QC < 20 %; další odstranění stabilně konstantních signálů pomocí IQR filtru (40 %).

Datová analýza a anotace:

• MS-DIAL (přímé čtení LabSolutions RAW): detekce, zarovnání, dekonvoluce DIA-MS/MS a primární anotace s použitím lipidomics workflow a .msp start-up kitu (obsahujícím MassBank) pro metabolity a lipidy.
• Export zarovnaných ploch pro statistiku do MetaboAnalyst: automatická imputace chybějících hodnot (1/5 minimální pozitivní hodnoty), kombinace pozitivních a negativních ionizačních režimů.
• Statistická selekce: volcano plot s kritérii fold change > 4 a p < 0.05 pro výběr nejvýznamnějších funkcí.

Použitá instrumentace

• UHPLC: Shimadzu Nexera X2.
• Kolona: C18 reversed-phase, 2.1 × 100 mm, 1.7 µm.
• QTOF MS: Shimadzu LCMS-9030 (metodu lze aplikovat i na LCMS-9050).
• Parametry ESI: interface 300 °C; napětí +1.5 kV (ESI+) / -3.0 kV (ESI-); heat block 400 °C; DL 250 °C.

Hlavní výsledky a diskuse

Po aplikaci výše uvedeného workflow bylo zjištěno výrazné pozměnění metabolického profilu jater u myší vystavených ethanolu ve srovnání s kontrolami. Z výsledného výběru signifikantních funkcí (fold change > 4, p < 0.05) bylo anotováno 15 kandidátních markerů alkoholové toxicity v játrech. Mezi identifikovanými změnami byly jak polaritní metabolity (např. L-citrullin, taurin), tak různé třídy lipidů (lysoPC, PC, PE, acylkarnitiny a N-acyl-tauriny). Ethyl oleate byl potvrzen jako úroveň MSI 1 na základě porovnání retenčního času a MS/MS s autentickým standardem za stejných podmínek. Většina ostatních anotací odpovídá MSI úrovni 2 (porovnání MS/MS s externími databázemi).

Diskuse výsledků:

• Změny v profilech lysofosfolipidů a esterifikovaných mastných kyselin poukazují na modifikace lipidového metabolismu a integritu membrán při alkoholové expozici.
• Nárůst či pokles specifických N-acyl-taurin a acylkarnitin může odrážet posun v beta-oxidaci a detoxifikačních cestách souvisejících s ethanolem.
• DIA přístup umožnil zachytit MS/MS spektra pro většinu detekovaných funkcí, což zjednodušuje anotaci bez potřeby cíleného DDA za běžných podmínek rutinního provozu.

Přínosy a praktické využití metody

• End-to-end postup poskytuje snadno implementovatelný protokol pro laboratoře s omezenou MS-expertizou, zahrnující přípravu vzorků, QC, akvizici a softwarovou analýzu.
• DIA-MS/MS v kombinaci s MS-DIAL umožňuje konzistentní získávání fragmentačních spekter pro široké spektrum funkcí při krátkém cyklickém čase (1 s).
• Metoda je vhodná pro studií biomarkerů hepatotoxicity, toxikologické screeningy a průmyslové aplikace vyžadující robustní untargeted přístup k lipidomice a metabolomice.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace kvantitativních cílených analýz pro vybrané kandidáty (MSI úroveň 1) k validaci biomarkerů a k rozšíření biologického významu nálezů.
• Využití širších a vícevrstevných databází spekter a strojového učení pro automatizovanější a přesnější anotaci funkcí v komplexních maticích.
• Rozšíření workflow na jiné tkáně a biofluidy a kombinace s ortogonálními technikami (např. HILIC pro polaritní metabolity, ion-mobility separace) pro lepší pokrytí metabolomu.
• Standardizace QC a sdílené referenční sady pro zvýšení přenositelnosti dat mezi laboratořemi a instrumenty.

Závěr

Studie demonstruje, že vysokorozlišovací LC/QTOF s DIA-MS/MS a zpracováním v MS-DIAL představuje praktické a robustní řešení pro untargeted metabolomiku jaterních tkání při studiu ethanolu. Workflow vedlo k identifikaci 15 potenciálních markerů ethanolové toxicity, včetně jednoho potvrzeného standardem (ethyl oleate). Metoda je flexibilní, vhodná pro rutinní aplikace a připravená pro další rozšíření směrem k validaci biomarkerů a širším metabolomickým studiím.

Reference

1. Kirwan JA, Gika H, Beger RD, et al. Quality assurance and quality control reporting in untargeted metabolic phenotyping: mQACC recommendations for analytical quality management. Metabolomics. 2022;18(9).
2. Spicer R, Salek R, Steinbeck C. A decade after the metabolomics standards initiative, it's time for a revision. Sci Data. 2017;4:170138.