Increasing Reporting Confidence in Metabolomics; Reversed-Phase and HILIC LC/QTOF Untargeted Analysis in Multiple Tissue Studies

Význam tématu

Metabolomika tkání představuje náročnou analytickou disciplínu kvůli extrémní chemické a fyzikální rozmanitosti metabolitů. Vysoká pokrytí metabolomu a zároveň spolehlivá identifikace jsou nezbytné pro biologické interpretace výsledků (např. studie patologických stavů nebo účinků léčiv). Kombinace reverzní fáze (RP) a HILIC chromatografie spolu s datově nezávislým získáváním fragmentačních spekter (DIA-MS/MS) poskytuje robustní a škálovatelné řešení pro zvýšení jistoty hlášení, zejména u silně polárních a izobarických sloučenin.

Cíle a přehled studie / článku

Účelem předložené aplikace bylo demonstrovat univerzální DIA-MS/MS workflow pro netargetovanou metabolomiku tkání, které kombinuje RP a HILIC separace. Metoda má být použitelná pro LCMS-9030/9050 platformy a měla by zvýšit metabolomickou pokrytí i jistotu identifikací napříč různými typy tkání (mozek, játra, pankreas, střevní obsah, caecum, stolice, plasma) v myších modelech. Studie ukazuje konkrétní případy, kde HILIC doplňuje RP, zvláště při řešení časně elujících složek a izobarických isomerů.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika:

• Vzorky: extracety tkání z různých murinních studií, rekonstituce v 90 % acetonitrilu.
• Chromatografie: paralelní použití RP a HILIC separací se stejným DIA-MS/MS nastavením.
• RP podmínky: C18 2.1×100 mm, 1.7 µm, 50 °C; mobile phase A: voda + 0.1 % FA, B: MeCN + 0.1 % FA; průtok 0.4 mL/min; injekce 0.5 µL; gradient do 90–100 % B pro rozdělení lipidů a méně polárních metabolitů.
• HILIC podmínky: Shim-pack Velox HILIC 2.1×100 mm, 2.7 µm, 40 °C; mobilní fáze s 10 mM ammonium formiátem + 0.1 % FA; počáteční vysoký obsah organiky (≈98 % B), průtok 0.3–0.4 mL/min; injekce 0.5 µL; autosampler 4 °C.
• MS akvizice: QTOF (LCMS-9030); ESI ± (300 °C, 1.5 kV/+; -3.0 kV/-); TOF-MS m/z 60–1000; DIA-MS/MS: 27 oken, izolace precursorů ~35 Da, collision energy spread 5–55 V; celkový cyklus MS+MS/MS ≈0.991 s.
• Zpracování dat: LabSolutions Insight; porovnání proti interní knihovně (autentické standardy, RUO); MS/MS spektra korigována na přesné teoretické hmotnosti.

Hlavní výsledky a diskuse

Klíčová zjištění:

• RP DIA-MS/MS poskytuje široké metabolomické pokrytí, výborné pro lipidy (LPC, LPE, glycerofosfolipidy, mastné kyseliny a konjugáty) a pro řadu polárních metabolitů (nukleotidy, aminokyseliny, puriny, pyrimidiny).
• U velmi polárních metabolitů byly na RP chromatografii pozorovány značné koeluce a velmi rané eluce (např. 0.7–0.85 min), což snižuje jistotu identifikace kvůli chimerickým MS/MS spektrům.
• Přechod na HILIC výrazně zlepšil separaci polárních a izobarických látek — typicky s RT variabilitou <0.25 % v rámci batch (n=55), konkrétně RT %RSD u vybraných metabolitů 0.12–1.18 %.
• HILIC umožnil rozlišení izobarů, které na RP koelovaly: m/z 118.0863 (valin, 5-aminopentanoát, norvalin, trimethylglycin/betainu), m/z 146.1176 (acetylcholin vs 4-trimetylammoniobutanoát), leucine/isoleucine, alanine/β-alanine apod.
• Použití HILIC snížilo potenciální falešně pozitivní identifikace u silně polárních metabolitů díky zvýšené chromatografické selektivitě a ověření s autentickými standardy.

Diskuse:
Výsledky potvrzují, že kombinované chromatografické přístupy s jednotnou DIA-MS/MS akvizicí představují efektivní způsob, jak zvýšit jak pokrytí metabolomu, tak reporting confidence. HILIC není náhradou RP, ale klíčovým doplňkem při analýze vodorozpustných a izobarických metabolitů, zejména v komplexních matricích jako jsou střevní obsah nebo faeces.

Přínosy a praktické využití metody

Praktické výhody:

• Zvýšená jistota identifikací u polárních sloučenin vedoucí k nižšímu FDR (false discovery rate) v netargetovaných studiích.
• Širší metabolomické pokrytí (lipidy i polární metabolity) bez zásadného zvýšení komplikovanosti workflow – stejná DIA-MS/MS akvizice použitelná pro obě chromatografie.
• Vysoká robustnost a stabilita RT v HILIC (>0.25 % RT variabilita), vhodné pro velké dávky vzorků a srovnatelné studie (n>50).
• Užitečné pro biologické studie zahrnující různé tkáně a interakce s mikrobiomem (např. modely s antibiotickou léčbou) a pro identifikaci biologicky relevantních změn (např. účinky etanolu na mozek).

Budoucí trendy a možnosti využití

Možné směry dalšího rozvoje a aplikace:

1. Integrace iontové mobility (IM) k další separaci izobarů a zlepšení dekonvoluce chimerických spekter.
2. Rozšíření a standardizace MS/MS knihoven s validovanými HILIC a RP RT, včetně veřejných repozitářů pro lepší mezilaboratorní porovnatelnost.
3. Využití strojového učení pro automatické rozpoznání koelucí a dekompozici DIA spekter.
4. Vývoj multipozičních (orthogonálních) workflow – např. sekvenční RP→HILIC analýza vzorků, případně kombinace s derivatizací pro specifické třídy metabolitů.
5. Standardizace metodik pro klinické a regulační studie s důrazem na kontrolu kvality, interní standardy a referenční materiály.

Závěr

Prezentované řešení ukazuje, že jednotná DIA-MS/MS akvizice kombinovaná s RP a HILIC chromatografií zásadně zvyšuje důvěru v identifikaci metabolitů v náročných biologických matricích. Zatímco RP poskytuje široké pokrytí, HILIC kriticky zlepšuje rozlišení a identifikaci vysoce polárních a izobarických sloučenin. Tato komplementarita podporuje přesnější biologické interpretace a snižuje riziko falešných nálezů v netargetovaných metabolomických studiích.

Použitá instrumentace

• UHPLC: Shimadzu Nexera X2.
• Reverzní fáze: C18 2.1×100 mm, 1.7 µm (50 °C).
• HILIC: Shim-pack Velox HILIC 2.1×100 mm, 2.7 µm (40 °C).
• MS: Quadrupole Time-of-Flight (LCMS-9030; popř. LCMS-9050 kompatibilita).
• Software a knihovny: LabSolutions Insight, interní knihovna autentických standardů (MS/MS získaná cíleně; spektra korigována pomocí Insight Assign).

Reference

Publikace je aplikacním dokumentem firmy Shimadzu prezentujícím metodiku a výsledky validace pro výše uvedenou instrumentaci. Materiál vychází z interních studií a použitých autentických standardů (Research Use Only). Poznámky o patentech a ochranných známkách: Nexera a LabSolutions Insight jsou ochranné známky Shimadzu Corporation.