Untargeted Metabolomics Analysis of Pancreatic Cancer Using LC/QTOF

Význam tématu

Metabolomika poskytuje komplexní pohled na malé molekuly (metabolity) odrážející fyziologický stav organismu. V kontextu rakoviny pankreatu (PDAC) může identifikace metabolických markerů přispět k pochopení patobiologie, včasné detekci a vývoji terapeutických přístupů. Robustní, reprodukovatelná workflow pro untargeted metabolomiku jsou proto klíčové pro klinický výzkum, translaci výsledků a následné cílené validace.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo vyvinout a demonstrovat end-to-end LC/QTOF workflow pro untargeted metabolomiku, které je robustní, použitelné s minimální zkušeností s MS a kompatibilní s otevřenými nástroji pro zpracování dat. Workflow bylo aplikováno na srovnání sérových profilů pacientů s PDAC a zdravých kontrol za účelem identifikace potenciálních metabolických markerů onemocnění.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorový materiál a extrakce:

• Séra extrahována metanolem v poměru 1:3 (v/v).
• Pro pozitivní ionizaci byly extrakty naředěny 1:10 před UHPLC-MS/MS analýzou.

Chromatografie a akvizice dat (shrnutí hlavních parametrů):

• UHPLC: Nexera X2; kolona C18, 2.1 × 100 mm, 1.7 µm; teplota kolony 50 °C; průtok 0.4 mL/min; injekce 0.5 µL; autosampler 4 °C.
• Mobilní fáze: A = voda + 0.1 % kyselina mravenčí, B = acetonitril + 0.1 % kyselina mravenčí; gradient od 2 % B až po 100 % B s časovým profilem do 35 min (podrobný průběh zahrnutý v původním textu).
• Rinse: směs IPA/MeOH/MeCN/H2O (1:1:1:1) + 1 % kyseliny mravenčí.

Hmotnostní spektrometrie a nastavení MS:

• MS: LCMS-9030 (QTOF), pozitivní ESI.
• TOF-MS m/z 60–1000.
• DIA-MS/MS: 27 oken pokrývajících m/z 40–1000, izolace prekurzoru ~20 Da, collision energy spread 5–55 V.
• Celkový cyklový čas (MS + MS/MS) ~1 sekunda.

Kontrola kvality a pořadí analýz:

• Pooled QC vzorky z kombinace všech vzorků; náhodné pořadí analýz s injekcí QC po každých 6 vzorcích po vyrovnání systému.
• QC sloužily k monitorování stability signálu, přesnosti m/z a RT, a k filtrování nestabilních feature.

Zpracování a anotace dat:

• MS-DIAL použito pro detekci, vyrovnání (alignment) a počáteční anotaci. Využití lipidomické workflow s in-silico RT/MSMS databází a "start-up kit" .msp soubory (např. MassBank) pro metabolity.
• MetaboAnalyst použito pro statistickou analýzu (filtrování, imputační postupy, volcano plot, t-testy apod.).
• Filtrační kritéria: feature přítomné v ≥50 % pooled QC s RSD <20 % a přítomné v ≥80 % vzorků v jedné ze skupin (PDAC nebo kontrola).
• Imputace chybějících hodnot v MetaboAnalyst: výchozí náhrada 1/5 nejmenší pozit. hodnoty pro danou proměnnou.

Použitá instrumentace

• UHPLC: Nexera X2.
• Kolona: C18, 2.1 × 100 mm, 1.7 µm (reverzní fáze).
• MS: LCMS-9030 (Quadrupole Time-of-Flight, Shimadzu).
• Software: MS-DIAL (detekce, dekonvoluce DIA, alignment, anotace), MetaboAnalyst (statistika).

Hlavní výsledky a diskuse

Detekce a statistika:

• Celkem bylo v pozitivním módu identifikováno 229 feature, které splnily statistická kritéria (fold change >1.5, p < 0.1) v porovnání PDAC vs. kontrola.
• Po ruční revizi anotací (vyloučení léků, nepřesných RT, duplikátních aduktů a neidentifikovaných signálů) zůstalo 45 funkcí s úrovní anotace MSI level 2 jako potenciální markery PDAC.

Vybrané metabolity a trendy:

• Mezi zvýšenými i sníženými metabolity se objevily různé třídy lipidů (lyso-PC, PC, PE, SM), acylkarnitiny a malé molekuly jako L-glutamát a hippurová kyselina.
• Boxploty ukázaly rozdíly v distribuci koncentrací těchto anotovaných složek mezi PDAC a kontrolami.

Interpretace a omezení:

• Workflow ukázal schopnost najít biologicky relevantní rozdíly; avšak anotace zůstávají na úrovni putativní identifikace (MS/MS srovnání s externími spektry). Definitivní potvrzení vyžaduje standardy nebo cílené kvantifikace.
• Analýza byla omezena na pozitivní ionizační mód; některé relevantní metabolity mohou být lépe detekovatelné v režimu negativním.
• Statistická kritéria (p<0.1) jsou relativně liberální — vhodné pro objevnou fázi, nikoli pro definitivní biomarkerovou validaci bez reprodukce a validace v nezávislé kohortě.

Přínosy a praktické využití metody

• Workflow nabízí praktické, škálovatelné řešení pro untargeted metabolomiku, dostupné i laboratořím s omezenými zkušenostmi s MS díky čitelným nastavením akvizice a podpoře open-source nástrojů.
• Kompatibilita s MS-DIAL a MetaboAnalyst umožňuje snadné začlenění do existujících bioinformatických pipeline a interoperabilitu s dalšími nástroji (MZmine, GNPS, XCMS).
• Metodika je vhodná pro průzkumné studie, identifikaci kandidátních biomarkerů a následnou práci na ověření pomocí cílených analýz.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření na negativní ionizační mód a více chromatografických přístupů (HILIC + RP) pro širší pokrytí metabolomu.
• Propojení s cílenými kvantitativními metodami pro validaci kandidátů a vývoj diagnostických testů.
• Důraz na standardizaci QC a reportování (podle mQACC a MSI) pro zlepšení reprodukovatelnosti mezi laboratořemi.
• Využití rozsáhlejších a kvalitnějších MS/MS knihoven a pokročilých algoritmů pro de-novo anotaci a strojové učení pro lepší prioritizaci markerů.
• Integrace s dalšími „omics“ (proteomika, genomika) pro systémové pochopení PDAC a identifikaci funkčních drah.
• Opatření pro klinickou translaci: větší kohorty, longitudinální studie a multi-center validace.

Závěr

Popsané LC/QTOF DIA workflow poskytuje praktický a reprodukovatelný přístup k untargeted metabolomice séra, umožňující detekovat a anotovat stovky signálů a identifikovat desítky kandidátních markerů PDAC. Kombinace vhodné QC strategie, MS-DIAL pro zpracování a MetaboAnalystu pro statistiku vytváří ucelenou cestu od surových dat k biologickým poznatkům. Nicméně pro klinickou aplikaci je nutná další analytická a klinická validace identifikovaných kandidátů.

Reference

1. Kirwan JA, Gika H, Beger RD, et al. (2022) Quality assurance and quality control reporting in untargeted metabolic phenotyping: mQACC recommendations for analytical quality management. Metabolomics. 18(9).
2. Spicer R, Salek R, Steinbeck C. (2017) A decade after the metabolomics standards initiative it's time for a revision. Sci Data. 4:170138.