Amino Acid Sequence Analysis of Semaglutide

Význam tématu

Peptidová léčiva představují rostoucí třídu terapeutik kombinující selektivitu biologických makromolekul a farmakologickou použitelnost menších molekul. S narůstající složitostí chemických modifikací (non‑natural aminokyseliny, mastné kyseliny na bočních řetězcích, cyklizace) roste i potřeba spolehlivých analytických postupů pro ověření přesné aminokyselinové sekvence a přítomnosti modifikací. Popisovaná kombinace Edmanovy degradace (PPSQ protein sequencer) a MALDI‑TOF MS poskytuje komplementární informace: sekvenční určení z N‑terminu a rychlé stanovení molekulové hmotnosti pro identifikaci modifikací a ověření integrity produktu.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo ukázat analytický postup pro zjištění aminokyselinové sekvence syntetického peptidu semaglutidu (31 residuí, upravený GLP‑1) a doplnit sekvenční data o celkovou molekulovou hmotnost. Studie demonstruje, že Edmanova degradace s PTH‑derivaty dokáže identifikovat i non‑natural aminokyselinu 2‑aminoisobutyrát (Aib) a že kombinace s MALDI‑TOF MS umožňuje odhad hmotnosti bočně vázaného mastného řetězce na Lys20.

Použitá metodika a instrumentace

Krátký přehled workflowu a vzorkování:

• Vzorek: semaglutide (komerční standard); rozpouštěn v 5 % octové kyselině na 100 pmol/µL; 5 µL (500 pmol) naneseno na polybrenem ošetřený skleněný filtr pro Edmanovu degradaci.
• Edmanova degradace a separace PTH‑derivátů: automatický protein sequencer PPSQ‑51A/53A; PTH‑amino kyseliny separovány HPLC s UV detekcí při 269 nm.
• Chromatografické režimy: porovnány izokratický a gradientní režim (specifické kolonové typy optimalizované pro PTH‑deriváty), teplota kolon ~35–40 °C, průtoky 0.3–1.0 mL/min a programované změny průtoku/uvedení elučního gradientu podle typu analýzy.
• Molekulová hmotnost: MALDI‑TOF MS (MALDI‑8030) s matricí α‑cyano‑4‑hydroxycinnamová kyselina (CHCA). Vzorek ředěn acetonitril:0.1 % TFA (1:1) na konečnou koncentraci cca 10 pmol/µL.

Hlavní výsledky a diskuse

Identifikace Aib a rozlišení od Arg:

• PTH‑derivát Aib (2‑aminoisobutyrát) se eluuje v pozici blízké PTH‑Arg, ale je odlišitelný díky rozdílnému retenčnímu času; potvrzeno v obou chromatografických režimech.

Narušení v oblasti modifikovaného Lys20:

• V cyklu 20 (pozice Lys upravený mastnou kyselinou) nebyl pozorován tradiční zvýšený PTH‑signál; možné příčiny: zabrždění Edmanovy degradace kvůli postranní modifikaci, silná retence extrémně hydrofobního PTH‑derivátu na analytické koloně, nebo degradace modifikace během degradace.
• Cyklus 21 vykázal charakteristický PTH‑Glu a doprovodný vedlejší produkt PTH‑Glu, což umožnilo lokalizovat Glu na pozici 21.

Detekce C‑terminu a rozdíly mezi režimy:

• V izokratickém režimu nebylo možné detekovat C‑terminální residuum (chybějící typické zvýšení PTH signálů u konce sekvence). V gradientním režimu byla v cyklu 31 potvrzena přítomnost Gly jako C‑terminální aminokyseliny, což ukazuje vyšší citlivost a lepší eluční chování pro pozdní cykly.

MALDI‑TOF výsledky a odhad modifikace:

• MALDI‑TOF potvrdil průměrnou [M+H]+ m/z = 4114.8 pro semaglutide.
• Spojením sekvenčních dat (identifikované residua) a celkové hmotnosti byl odhadnut průměrný přírůstek hmotnosti při pozici 20 na ≈844.2 Da, korespondující s mastnou kyselinou vázanou na boční řetězec Lys.

Celkové zhodnocení:

• PPSQ systém pro Edmanovu degradaci je vhodný pro analýzu syntetických peptidů s non‑natural aminokyselinami. Nicméně u silně modifikovaných, vysoce hydrofobních derivátů (např. mastně modifikovaný Lys) může Edmanova metoda selhávat v přímé detekci derivátu a vyžaduje doplňující analýzy.

Přínosy a praktické využití metody

Praktické výhody kombinace Edmanovy degradace a MALDI‑TOF MS:

• Rychlé ověření pořadí aminokyselin od N‑terminu včetně non‑natural residuí (např. Aib), které nejsou dostupné v genomických databázích.
• MALDI‑TOF poskytuje rychlé a přesné celkové molekulové hmotnosti, užitečné pro odhad a potvrzení přítomnosti modifikací či degradace produktu.
• Metoda je vhodná pro kontrolu kvality syntetických peptidů během vývoje a výroby, kde je nutné potvrdit sekvenci a integritu molekuly.

Budoucí trendy a možnosti využití

Navržené směry dalšího rozvoje analytiky peptidů:

• Integrované analytické přístupy: kombinace Edmanovy degradace s LC‑MS/MS (tandemní vysoko‑rozlišovací hmotnostní spektrometrie) či top‑down proteomikou pro lokalizaci a charakterizaci bočních modifikací.
• Využití derivatizace a optimalizovaných stacionárních fází pro lepší eluční chování hydrofobních PTH‑derivátů.
• Zlepšení citlivosti a selektivity pomocí moderních matricek a technik MALDI, případně použití ESI‑MS pro detailní mapování modifikovaných peptidů.
• Automatizace a kombinace dat z více technik pro rychlé QA/QC workflow v biofarmaceutickém vývoji.

Závěr

Kombinace Edmanovy degradace (PPSQ‑51A/53A) a MALDI‑TOF MS poskytuje robustní přístup pro potvrzení aminokyselinové sekvence syntetických peptidů obsahujících non‑natural residua a pro získání doplňujících informací o molekulové hmotnosti modifikací. Gradientní chromatografický režim zvyšuje citlivost a usnadňuje detekci C‑terminálních zbytků. Omezení nastávají u silně hydrofobních, bočně modifikovaných derivátů (např. mastně upravený Lys), které nemusí být detekovány přímo Edmanovou cestou a vyžadují doplňující hmotnostní spektrometrii nebo alternativní chemické postupy.

Reference

1. Lotte Bjerre Knudsen and Jesper Lau. The Discovery and Development of Liraglutide and Semaglutide. Section Molecular and Structural Endocrinology, 10 (155), 1–32 (2019).