Improving the Yield of Basic Amino Acids in a Protein Sequencer

Zvýšení výtěžnosti zásaditých aminokyselin v proteinovém sekvenceru

Význam tématu

Analýza N-terminální sekvence proteinů pomocí Edmanovy degradace je klíčová pro ověření identity a kvality biotechnologicky vyráběných léků. Nízká výtěžnost derivátů zásaditých aminokyselin (argininu, histidinu, lyzinu) však může snižovat spolehlivost stanovení sekvence, zejména při omezené množství vzorku.

Cíle a přehled studie / článku

Hlavním cílem příspěvku je představit vylepšený protokol pro extrakci a aplikaci vzorku při Edmanově degradaci, který zvyšuje výtěžnost PTH-aminokyselin zásaditých zbytků. Popisovány jsou modifikace v atmosféře konverzní reakce a způsoby nanášení vzorku na nosič.

Použitá metodika

Edmanova degradace probíhá ve čtyřech krocích: 1) vazba fenylisothiokyanátu na N-terminus, 2) kyselá hydrolýza, 3) extrakce vzniklých PTH-aminokyselin do organické fáze, 4) chromatografická analýza pod gradientními podmínkami. Pro vylepšení výtěžnosti zásaditých zbytků byly provedeny dvě změny:

• extrakce ATZ-aminokyselin v mírně zásadité atmosféře namísto kyselé
• přídavek polybrenu při nanášení vzorku na nosič k omezení vyplavení zásaditých peptidů

Použitá instrumentace

Analýzu prováděl proteinový sekvencer PPSQ-51A/53A vybavený:

• kolonou Wakopak Wakosil PTH-GR (250 mm × 2,0 mm I.D.)
• mobilními fázemi A a B určenými pro PTH-aminokyseliny
• průtokem 0,3 mL/min při 35 °C
• UV detekcí při 269 nm s vysokocitlivou měřící kyvetou

Hlavní výsledky a diskuse

Porovnání chromatogramů běžného a vylepšeného protokolu ukázalo významné zvýšení procentuální výtěžnosti PTH-derivátů zásaditých zbytků lysinu, histidinu a argininu. Zvýšení však bylo provázeno mírně vyšším základním šumem, který ale neovlivnil identifikaci ani kvantifikaci.

Přínosy a praktické využití metody

Vylepšení protokolu přispívá k vyšší spolehlivosti N-terminálních stanovení při malém množství vzorku a zjednodušuje následné softwarové vyhodnocení. Je vhodné pro QA/QC biofarmaceutických výrobků, výzkumné laboratoře i průmyslovou analytiku.

Budoucí trendy a možnosti využití

Možné směry dalšího vývoje zahrnují:

• další optimalizaci nosičů a povrchových úprav pro lepší retenci zásaditých peptidů
• integraci MS detektoru pro potvrzení sekvence a struktury
• automatizaci protokolu v rámci high-throughput platforem
• využití strojového učení pro predikci výtěžnosti a optimalizaci reagencií

Závěr

Navržené modifikace Edmanovy degradace v zásadité fázi extrakce a přidání polybrenu při aplikaci vzorku výrazně zvyšují výtěžnost derivátů zásaditých aminokyselin bez ztráty přesnosti stanovení. Protokol nachází uplatnění v kvalitativních a kvantitativních analýzách biotechnologických proteinů.