Analysis of the N-terminal Amino Acid Sequence of IgG Antibodies Using a Protein Sequencer (PPSQ ) Isocratic System

Význam tématu

Analýza N-terminální sekvence proteinů je klíčová pro ověření identity a integrity biotechnologických léčiv, zejména monoklonálních protilátek. I malé změny v primární struktuře mohou ovlivnit funkčnost, bezpečnost a stabilitu léčiva, proto spolehlivá a přesná metoda pro čtení N-konce proteinů zůstává nezbytnou součástí kontroly kvality a vývojových studií.

Cíle a přehled studie / článku

Studie popisuje aplikaci proteinového sekvenceru PPSQ-51A/53A (isokratický systém se SPD-40 detektorem) pro stanovení N‑terminální aminokyselinové sekvence humanizovaných IgG protilátek z CHO buněk. Cílem bylo demonstrovat postup přípravy vzorku, chromatografická nastavení a interpretaci výsledků pro lehký (L) a těžký (H) řetězec IgG a ověřit shodu získaných sekvencí s databázemi variabilních oblastí imunoglobulinů.

Použitá metodika a instrumentace

Metoda:

• Edmanova degradace: sekvenování postupným odštěpováním N-terminálních zbytků a jejich derivatizací na PTH‑aminokyseliny a následnou analýzou HPLC.
• Příprava vzorku: redukce a denaturace pro separaci H a L řetězců, SDS‑PAGE (gel 4–20 %), přenos na PVDF membránu elektroblotováním, krátké barvení Coomassie a vyříznutí pásů odpovídajících řetězcům.
• Vstupní množství: vzorek humanizované IgG1κ ředěný do ~3 pmol/µL, 10 µL naloženo na gel; před elektroforézou teplotní úprava 95 °C po dobu 25 min.

Instrumentace:

• Proteinový sekvencer: PPSQ-51A/53A (isokratický systém, Shimadzu).
• Detektor: SPD-40 detektor (detekce PTH‑aminokyselin při 269 nm).
• Kolona: Wakopak Wakosil PTH‑II, 250 mm × 4.6 mm I.D.
• Chromatografické podmínky: mobilní fáze pro PTH‑aminokyseliny, průtok 1.0 mL/min, teplota kolony 40 °C, analýza výjimečně neodděluje cystein jako PTH derivát.
• Pomůcky: PVDF membrána FluoroTrans, gel Novex TBE 4–20 %, přenosový buffer NuPAGE.

Hlavní výsledky a diskuse

Výsledky sekvenace byly získány u obou řetězců IgG a nadále ověřeny databázovým porovnáním:

• L‑řetězec: N‑terminální sekvence čtena až do 21. pozice: Asp‑Ile‑Gln‑Met‑Thr‑Gln‑Ser‑Pro‑Ser‑Ser‑Leu‑Ser‑Ala‑X‑X‑Gly‑Asp‑Arg‑X‑Thr. V cyklech 14, 15 a 19 byly signály buď slabé nebo vícerozměrné, což znemožnilo jednoznačnou identifikaci v těchto pozicích. Databázové vyhledávání identifikovalo sekvenci jako variabilní oblast lidského kappa lehkého řetězce.
• H‑řetězec: N‑terminální sled potvrzen v prvních pěti cyklech až do 18. pozice: Glu‑Val‑Gln‑Leu‑Val‑Glu‑Ser‑Gly‑Gly‑Gly‑Leu‑Val‑Gln‑Pro‑Gly‑Gly‑Ser‑Leu‑Arg‑Leu. Sekvence odpovídala variabilnímu genu IGHV3‑72.

Diskuse:

• Edmanova degradace poskytla spolehlivé čtení N‑konců s vysokou specifičností pro většinu aminokyselin. Nicméně nejednoznačné cykly mohou odrážet přítomnost post‑translačních modifikací, mikroheterogenity nebo nižší výtěžnosti v daném cyklu.
• Metoda má omezení: blokované N‑terminy, silné posttranslační modifikace nebo přítomnost cysteinu bez redukce/alkylace mohou snížit informativnost dat.

Přínosy a praktické využití metody

Edmanovo sekvenování s použitím PPSQ-51A/53A je užitečné pro:

• ověření identity biologických léčiv – přímé potvrzení N‑terminální primární struktury,
• detekci odchylek vzniklých během výroby nebo zpracování,
• analýzu variabilních oblastí protilátek při vývoji a charakterizaci kandidátů,
• situace, kde jsou sekvence neznámé nebo nejsou dostupné v databázích; metoda umožňuje de novo čtení N‑terminu.

Praktickým přínosem je také jednoduché ovládání softwaru a nižší provozní náklady díky isokratickému provozu HPLC.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry rozvoje a integrace techniky v analytické praxi zahrnují:

• kombinace Edmanova sekvenování s hmotnostní spektrometrií (LC‑MS/MS) pro komplexní informace o PTM a vnitřních sekvencích,
• zvýšení citlivosti a automatizace sekvencerů pro práci s menšími množstvími vzorku,
• vylepšená softwarová integrace s databázemi a algoritmy pro lepší rozpoznávání více-škálových signálů a modifikací,
• vývoj metod pro robustnější detekci cysteinu a modifikovaných zbytků v rámci Edmanových postupů nebo alternativních derivatizačních přístupů,
• širší využití při analýze biosimilars a při rutinním QA/QC v bioprodukci.

Závěr

PPSQ-51A/53A využívající Edmanovu degradaci prokázal schopnost přesně číst N‑terminální sekvence IgG protilátek izolovaných z CHO buněk. Metoda je dobře použitelná pro ověření identity a N‑terminální charakterizaci biopharmaceutik, přičemž isokratický provoz a uživatelsky přívětivý software snižují provozní náklady a usnadňují rutinní aplikaci. Omezení metody je třeba vzít v úvahu při interpretaci nejednoznačných cyklů nebo modifikovaných N‑terminů.

Reference

1. Goto A., Kuriki T., Analysis of the N-terminal Amino Acid Sequence of IgG Antibodies Using a Protein Sequencer (PPSQ) Isocratic System. Shimadzu Corporation, First Edition: Jun. 2026.
2. Shimadzu Corporation, PPSQ-51A/53A Protein Sequencer, Product Information and Application Notes, 2026.