Rapid-Turnaround Top-Down Sequence Verification and Characterization of Modified Proteins and Oligonucleotides Using a Benchtop MALDI-TOF/TOF Instrument

Rychlá top-down verifikace a charakterizace modifikovaných proteinů a oligonukleotidů pomocí benchtop MALDI-TOF/TOF

Význam tématu

MALDI Top-Down Sequencing (MALDI-TDS) poskytuje rychlý, LC-free přístup k ověření sekvence a identifikaci modifikací u intactních proteinů a oligonukleotidů. Díky tvorbě jedině nabitých in-source decay (ISD) fragmentů se výrazně zjednodušuje interpretace spekter (není třeba dekonvoluce nábojů), což zkracuje dobu analýzy a usnadňuje rozhodování v biotechnologickém vývoji a kvalitativní kontrole.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo demonstrovat schopnosti benchtop přístroje neofleX (MALDI-TOF/TOF) pro rychlou top-down sekvenační verifikaci a lokalizaci modifikací na třech reprezentativních vzorcích: recombinantní protein (29,7 kDa), silně modifikované RNA 39-mer a 5'-DBCO značené DNA 21-mer. Studie sleduje jak měření intact mass, tak MALDI-ISD top-down analýzu pro určení sekvence, detekci proteoform a lokalizaci modifikací.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika:

• Příprava vzorků na MALDI destičce s vhodným matrixem (různé matrixy pro intact mass vs ISD).
• Získání intact-mass spekter v pozitivním lineárním módu a MALDI-ISD spekter v pozitivním reflektor módu.
• Analýza dat s využitím softwaru OmniScape a BioTools pro přidružení fragmentních iontů (c, y, z+2, d, w atd.) a sestavení sekvenčního pokrytí.

Instrumentace (samostatná sekce):

Použitá instrumentace

• Bruker neofleX benchtop MALDI-TOF/TOF.
• Matrixy: 2,5-DHAP pro intact mass proteinů; SDHB pro MALDI-ISD u proteinů; 3-HPA a 2,4,6-THAP pro oligonukleotidy.
• Režimy akvizice: pozitivní lineární mód (intact mass), pozitivní reflektor mód (MALDI-ISD top-down).
• Software: Bruker OmniScape a BioTools pro interpretaci MALDI-ISD spekter.

Detail vzorků a příprava

• Recombinantní protein cutinase (Thermobifida alba, estl gene), hmotnost ~29,7 kDa, koncentrace 40 pmol/µl. Příprava: 2,5-DHAP для intact mass; SDHB pro MALDI-ISD.
• Silně modifikované RNA 39-mer (2'-O-methyl, 2'-fluoro, phosphorothioate), MW ~12,5 kDa, koncentrace 10 pmol/µl. Matrix: 3-HPA nebo 2,4,6-THAP.
• 5'-DBCO značené DNA 21-mer, MW ~7 kDa, koncentrace 10 pmol/µl. Matrix: 3-HPA nebo 2,4,6-THAP.

Hlavní výsledky a diskuse

Recombinantní protein (29,7 kDa):

• Intact-mass analýza potvrdila očekávanou hmotnost hlavního proteoformu, ale odhalila i minoritní proteoformu ~203 Da lehčí než hlavní forma.
• MALDI-ISD poskytlo sekvenační čtení až ~80 aminokyselin z N- i C-terminu v jednom spektru, což vedlo k >50% MS/MS sekvenčnímu pokrytí a rychlé verifikaci hlavního proteoformu.
• Minor proteoform byl identifikován jako N-terminálně zkrácená varianta chybějící dipeptid MA díky přítomnosti nízkointenzní řady N-terminálních c-typ fragmentů.
• Mezera v pokračujícím řetězci C-terminálních fragmentů (y, z+2) indikovala přítomnost disulfidového můstku mezi Cys242 a Cys260.

RNA 39-mer (silně modifikovaná):

• MALDI-ISD potvrdilo sekvenci RNA včetně komplexního modifikačního profilu (2'F, 2'O-Me, phosphorothioate) s přibližně 67% MS/MS pokrytím, primárně díky d- a w-typ fragmentům.

5'-DBCO DNA 21-mer:

• Sekvence DNA byla ověřena se ~85% MS/MS pokrytím. Fragmenty d-, y- a w-typ umožnily lokalizaci DBCO označení na 5'-konci.

Diskuse:

• MALDI-ISD generuje převážně singulárně nabité fragmenty, čímž eliminuje nutnost komplexní dekonvoluce, což výrazně zjednodušuje interpretaci zejména u větších intactních biomolekul.
• Schopnost rychle přepínat mezi analýzou proteinů a oligonukleotidů bez časově náročných změn eluentu/chemie (jak je obvyklé v LC–MS pracovních tocích) zvyšuje provozní flexibilitu v R&D a QC prostředí.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlé ověření identit a modifikací u rekombinantních proteinů a syntetických oligonukleotidů bez nutnosti separačních kroků.
• Detekce a lokalizace drobných proteoform (např. N-terminální truncate) a vazeb (disulfidy) v rámci jedné akvizice.
• Vhodné pro screening vzorků během fáze vývoje biologických léčiv, výrobních kontrol a analytické charakterizace nových modality (PEGylace, konjugace, chemické modifikace nukleových kyselin apod.).

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace MALDI-TDS do agilních workflow biopharma pipeline pro rychlé rozhodování o kvalitě a struktuře produktů.
• Vylepšení softwarových nástrojů pro automatizovanou anotaci ISD fragmentů a přesnější kvantifikaci proteoform.
• Rozšíření aplikací na další modality (konjugáty, velké oligonukleotidy, méně běžné posttranslační modifikace) a zlepšení citlivosti pro nižší množství vzorku.
• Možné kombinace s orthogonálními metodami (např. redukční/alkylující ošetření, vybrané enzymatické štěpení) pro detailnější mapování modifikací a vazeb.

Závěr

MALDI-TDS provedené na benchtop přístroji neofleX poskytuje robustní, rychlý a LC-free přístup k top-down verifikaci a charakterizaci modifikovaných proteinů a oligonukleotidů. Metoda efektivně identifikovala hlavní a minoritní proteoformy, lokalizovala disulfidový můstek a potvrdila sekvence a modifikace u syntetických nukleových kyselin s vysokým sekvenčním pokrytím v jediném měření. Tím má vysoký potenciál pro nasazení v laboratorním provozu a vývojových odděleních biopharmy.

Reference

• Bruker Application Note MT-142.
• Poděkování: recombinantní protein byl laskavě poskytnut Prof. Bart Devreese a Dr. Isabel Vandenberghe, University of Gent, Belgium.