Recombinant SARS-CoV-2 Receptor Binding Domain: Comprehensive Top-Down Sequence Confirmation, Curation and O-Glycosylation Site Determination

Význam tématu

Rekombinantní receptor binding domain (RBD) ze SARS-CoV-2 je klíčovým nástrojem pro vývoj diagnostiky, vakcín a základní výzkum virové infekce. Přesná znalost jeho sekvence a glykozylace ovlivňuje schopnost navázat se na receptor ACE2 a rozpoznání protilátkami. Charakterizace těchto proteoform je zásadní pro zajištění kvality a spolehlivosti používaných antigenů.

Cíle a přehled studie / článku

Tento článek popisuje komplexní top-down sekvenční analýzu a lokalizaci O-glykozylace RBD rekombinantně exprimovaných v buňkách CHO a HEK293. Cílem bylo potvrdit primární strukturu, vyčistit sekvence, identifikovat neočekávané úpravy a přesně určit glykozylovaná místa.

Použitá metodika a instrumentace

Pro přípravu vzorků byly použity následující postupy:

• Rekombinantní RBD s C-terminálním His6 tagem exprimovaný v buňkách CHO a HEK293
• Enzymatické odstranění N-glykanů (PNGase F) a O-glykanů (OglyZOR, SialEXO)
• Redukce disulfidických vazeb pomocí DTT
• MALDI-ISD Top-Down sekvenování na instrumentech rapifleX TOF/TOF a timsTOF fleX
• Zpracování dat v softwaru BioPharma Compass, DataAnalysis 5.3 a Biotools 3.2 SR7

Hlavní výsledky a diskuse

• CHO-RBD: sekvence plně potvrzena s teoretickou hmotností ~25923 Da
• HEK293-RBD: detekován posun +110,8 Da díky zbytku pro-peptidu s N-terminální pyro-Glu
• Automatizovaná analýza clippingu odhalila N-terminální rozšíření o pyro-Glu
• MALDI-ISD na timsTOF fleX jednoznačně lokalizovalo O-glykanizační místo pouze na Thr-6; Ser-8 nebyla glykosylována

Přínosy a praktické využití metody

Top-down MALDI-ISD umožňuje rychlé ověření celistvosti sekvencí proteoform a přesné lokalizace posttranslačních úprav, které mohou uniknout klasickému bottom-up přístupu. Metoda přispívá k robustnímu QA/QC rekombinantních proteinů používaných v diagnostice a vývoji léčiv.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace iontové mobility (TIMS) pro lepší separaci nízkomolekulárních fragmentů
• Využití v hloubkové glyko-profilaci dalších bioterapeutik
• Rozšíření automatizace a zrychlení analýzy pro náročné aplikace v klinickém výzkumu

Závěr

Top-down MALDI-ISD sekvenování na rapifleX a timsTOF fleX poskytlo detailní potvrzení struktury a glykozylace SARS-CoV-2 RBD. Metoda odhalila neočekávané N-terminální úpravy i přesnou lokalizaci O-glykanizačního místa, což podpořilo další hloubkovou glykoanalýzu a zaručilo kvalitu rekombinantních antigenů.

Reference

• Gstöttner C Zhang T Resemann A a kol 2021 Structural and functional characterization of SARS-CoV-2 RBD domains produced in mammalian cells Anal Chem doi:10.1021/acs.analchem.1c00893
• Welsink T Wolfenstetter S 2021 SARS-CoV-2 antigens successfully produced with comparable quality from transient transfection and stable cell pool expression systems InVivo Application Note
• Gstöttner C Domínguez-Vega E Wuhrer M 2021 Proteoform characterization of recombinant SARS-CoV-2 Receptor Binding Domains Bruker Application Note LCMS-187
• Roberts DS Mann MW Melby JA a kol 2021 Structural O-Glycoform Heterogeneity of the SARS-CoV-2 Spike Protein Receptor-Binding Domain Revealed by Native Top-Down Mass Spectrometry BioRxiv doi:10.1101/2021.02.28.433291
• Resemann A Jabs W Wiechmann A a kol 2016 Full validation of therapeutic antibody sequences by middle-up mass measurements and middle-down protein sequencing MAbs 8(2):318-330 doi:10.1080/19420862.2015.1128607
• Asperger A Resemann A Evers W a kol 2021 Next Generation MALDI Top-Down Sequencing of protein biotherapeutics Expanding the scope of timsTOF technology Bruker Application Note LCMS-186