Exploring the proteomics capabilities of a new Trapped Ion Mobility Q-TOF designed for enhanced metabolomics performances

Význam tématu

Rychlý rozvoj multi-omických studií zvyšuje nároky na LC–MS platformy, které musí poskytovat současně vysokou citlivost, široký dynamický rozsah a rychlý průtok dat napříč proteinovou, metabolitovou a lipidovou analýzou. Nový Trapped Ion Mobility Q-TOF označený jako timsMetabo byl navržen primárně pro lepší přenos nízkých m/z iontů (metabolomika), nicméně praktický zájem spočívá v ověření, zda tyto optimalizace negativně neovlivní nebo naopak udrží výkonnost v proteomice. Studie je důležitá, protože ukazuje, zda jedna univerzální platforma může efektivně sloužit v multi-omics pracovních postupech bez kompromisů v hloubce či kvantitativní přesnosti proteomických měření.

Cíle a přehled studie

Hlavní cíle studie byly:

• ověřit schopnosti timsMetabo v oblasti discovery proteomiky (hloubka identifikací, dynamický rozsah, throughput) ve srovnání s předchozími timsTOF platformami,
• posoudit citlivost a kvantitativní přesnost v cílené režimu (prm-PASEF) na komplexním matrixu (neat plasma),
• vyhodnotit vliv délky chromatografického gradientu a nastavení duty-cycle na počet identifikovaných prekurzorů a proteinových skupin.

Studií byly analyzovány digesty K562 (Promega) a neat plazma při dávce 100 ng na kolonu s použitím krátkých (22 min) až delších (60 min) gradientů; byla porovnána dia-PASEF, prm-PASEF a klasická PASEF (DDA). Data byla zpracována bez použití match-between-runs (MBR) pro objektivní srovnání citlivosti a hloubky identifikací.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky a chromatografie:

• Vzorky: komerční k562 digest (Promega) a neat lidská plazma; do vzorků byly přidány isotopologní peptidy (Peptide Reference mix, Promega) pro stanovení LOQ.
• Kolona: 25 cm × 75 µm (Ion Opticks).
• LC: nanoElute2 nano-HPLC; průtok 250 nl/min; gradienty 22, 44 a 60 minut (5 % → 35 % ACN).

Hmotnostní spektrometrie a akviziční režimy:

• MS: timsMetabo (Bruker) s prvky TIMS-MX cartridge, Athena Ion Processor (AIP) a Mobility Range Extension (MoRE) scan mode.
• Režimy akvizice: dia-PASEF (redukovaný duty cycle), prm-PASEF (targeted) a PASEF (DDA).
• Parametry dia-PASEF: 24×25 Th oken pokrývající 400–1000 m/z rozmezí, rozdělené na 8 PASEF ramp; pro PASEF (DDA) bylo plánováno 5 PASEF ramp na cyklus s 300 Hz akvizicí.
• Pro targeted prm-PASEF byl použit duty cycle ~30 % jako kompromis citlivosti a průchodnosti.

Zpracování dat:

• dia-PASEF: DIA-NN v2.0.1 v library-free režimu; databáze SwissProt Homo sapiens (release 02-2025) a Mus musculus (release 01-2025) podle analyzovaného materiálu; MBR nebyl zapnut.
• PASEF DDA: FragPipe v22.0.
• prm-PASEF: Skyline-daily v26.1 pro kvantifikaci a LOQ výpočty.

Hlavní výsledky a diskuse

Výkonnost discovery proteomiky:

• S dia-PASEF a 22min gradientem bylo identifikováno až 69 000 prekurzorů a 7,2k (7 200) proteinových skupin při injikované dávce 100 ng; výsledky jsou srovnatelné s dřívějšími výsledky získanými při 200 ng a 100% duty cycle, což naznačuje efektivitu nového setupu i při nižším vzorkovém zatížení.
• Zvýšení gradientu na 60 min zvýšilo počet prekurzorů na ~103k a počet proteinových skupin na ~8,2k, čímž se potvrdil běžný benefit delší chromatografické separace pro hloubku identifikací.
• PASEF (DDA) dosáhla 28k peptidů a 4,7k proteinů při 22 min a 62k peptidů a 6,5k proteinů při 60 min, což ukazuje, že platforma zůstává vhodná pro DeNovo, immunopeptidomiku či metaproteomiku vyžadující vysokou selektivitu spekter.

Neat plazma:

• Při 100 ng injekci neat plazmy bez specifické optimalizace dia-PASEF metoda poskytla v průměru ~412 proteinových skupin a ~5050 prekurzorů.
• Dynamický rozsah kvantifikovaných proteinů v plazmě sahal přibližně přes 5 řádů velikosti, což odpovídá očekávání pro tento typ biologického matrixu.

Cílená kvantifikace (prm-PASEF):

• Targetovaný režim s isotopologními peptidy ukázal limit kvantifikace (LOQ) až do 25 amol na kolonu při výborné lineární závislosti (R2 > 0,99) i v přítomnosti komplexního pozadí (100 ng neat plazmy) a při krátkém 22min gradientu.
• Spektrální kvalita na LOQ úrovni byla zachována, což dokládá vhodnost timsMetabo pro vysoce citlivé cílené aplikace.

Interpretace výsledků:

• Navzdory konstrukční optimalizaci pro lepší přenos nízkých m/z (metabolomika) systém zachovává vysokou výkonnost v proteomice — jak v discovery, tak v cíleném režimu.
• Možné kompromisy mezi duty cycle a citlivostí jsou řešitelné nastavením ~30% duty cycle pro prm-PASEF, čímž se dosahuje rozumné rovnováhy mezi citlivostí a průtokem vzorků.

Přínosy a praktické využití metody

Praktické přínosy a vhodné aplikace timsMetabo v proteomice:

• Univerzální multi-omics platforma: vhodná pro laboratoře provádějící současně proteomiku, metabolomiku a lipidomiku bez nutnosti samostatného vybavení.
• Vysoký throughput: krátké gradienty (22 min) již poskytují stovky proteinových skupin a desítky tisíc prekurzorů, užitečné pro studia s velkým počtem vzorků.
• Discovery proteomika a DeNovo aplikace: vysoká početnost prekurzorů a možnost DDA PASEF pro identifikace bez závislosti na knihovnách.
• Citlivá cílená kvantifikace: LOQ do aktoamolové úrovně v komplexním matrixu (plazma), vhodné pro biomarkerické a klinické výzkumné účely (pozn.: nástroj je určen pro výzkum pouze, není diagnostický).
• Specifické aplikace: immunopeptidomika, metaproteomika, cross-linking studie, kde je důležitá selektivita a spektrální kvalita.

Budoucí trendy a možnosti využití

Možné směry dalšího rozvoje a aplikací:

• Optimalizace dia-PASEF oken a ramp pro dosažení ještě vyšší hloubky při krátkých gradientech; inteligentní plánování oken založené na charakteristice vzorků.
• Integrace MBR nebo hybridních library-based přístupů pro zvýšení citlivosti v longitudinálních studiích, přičemž je nutné zohlednit riziko falešných pozitiv.
• Rozšíření použití MoRE/AIP pro zlepšení detekce nízkých m/z metabolitů při současném zachování proteomických výkonů — cesta k plně integrovaným multi-omics workflowům.
• Automatizace a škálování pro klinické kohortní studie: zkrácení doby analýzy a robustní kvantifikace pro vysokopropustné projekty.
• Vývoj pokročilých algoritmů pro library-free analýzu a lepší využití ion mobility informací ve vyhledávání a kvantifikaci.

Závěr

Studie ukazuje, že timsMetabo, ačkoliv je optimalizován pro metabolomiku a zlepšený přenos nízkých m/z, si zachovává robustní kapacity pro proteomiku: vysokou hloubku identifikací, široký dynamický rozsah a vynikající citlivost v cíleném režimu. Platforma tak představuje atraktivní benchtop řešení pro laboratoře, které vyžadují flexibilitu mezi proteo- a metabolomickými režimy bez ztráty výkonu. Pro výzkumné a aplikované multi-omics scénáře nabízí timsMetabo vyvážené kompromisy mezi throughputem, citlivostí a kvalitou dat.

Reference

Údaje ve shrnutí vycházejí z interní studie výrobcem instrumentace (Bruker) provedené autory: Benoit Fatou, Helena Alamil, Manuel Chapelle, Andreas Schmidt, Verena Tellstroem, Sabine Jourdain, Jocelyn Dupuy, Silke Neustifter, Pierre-Olivier Schmit (Bruker Daltonique/Bruker Daltonik). Použité nástroje a softwarové verze zahrnují: DIA-NN v2.0.1, FragPipe v22.0, Skyline-daily v26.1, SwissProt databáze (release 02-2025 Homo sapiens; release 01-2025 Mus musculus). Studie uvádí, že autoři jsou zaměstnanci Bruker a mohou mít finanční zájmy ve společnosti. Studie je označena jako For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.