Underivatized Amino Acid Profiling in Fermentation Samples with Novel High-Resolution Mass Spectrometry Platform with Bio-Compatible Column and LC

Význam tématu

Analýza volných (neodvozených) aminokyselin v mateřských médiích bioprocesů poskytuje klíčové informace o metabolismu mikroorganismů, výživném stavu kultur a průběhu fermentace. Rychlé, robustní a citlivé kvantitativní metody bez nutnosti derivatizace zjednodušují workflow, snižují čas přípravy vzorků a omezují potenciální analytické artefakty, což je prakticky důležité pro kontrolu kvality potravinářských a biotechnologických fermentací.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo ověřit a představit workflow pro analýzu nederivovaných aminokyselin v komplexním matrice fermentačního média Saccharomyces cerevisiae. Studie porovnává chromatografické rozlišení, kvantitativní rozsah a reprodukovatelnost použitím bio-inertního HILIC sloupce Altura v kombinaci s bio-kompatibilním LC a vysokorozlišujícím TOF hmotnostním spektrometrem Agilent 6230C. Dále byla sledována dynamika spotřeby aminokyselin během fermentace a možnost současného monitorování organických kyselin a sacharidů.

Použitá metodika a instrumentace

Popis vzorků a příprava:

• Organismus: Saccharomyces cerevisiae (ATCC 204508) pěstovaný v naředěném Yeast Peptone Dextrose (YPD) při 30 °C.
• Sběr: diskrétní časové body každé 2 hodiny 0–12 h plus 24 h; odstředění a sběr supernatantu.
• Příprava pro LC/MS: 1:4 ředění supernatantu do 50 % MeOH:H2O, odstředění; následné 20× ředění do 70:20:10 ACN:H2O:MeOH před injekcí.
• Kalibrace: standardy Agilent Amino Acid (rozsahy 50–50 000 nM; některé křivky kvadratické).

Chromatografie (klíčové body):

• Sloupec: Agilent Altura Poroshell HILIC‑Z, 2.1×150 mm, 2.7 µm (PN 227215‑924).
• LC: Agilent 1290 Infinity II Bio LC.
• Mobilní fáze: 10 mM acetát amonný pH 9.0 (A); 10 mM acetát amonný pH 9.0 v 90:10 ACN:H2O (B).
• Tok: 0.25 mL/min; teplota sloupce 30 °C; autosampler 4 °C; injekce 3 µL; gradient 25 min (start 90 % B, přechody na 40–20 % B a návrat).

Hmotnostní spektrometrie (klíčové body):

• Instrument: Agilent 6230C TOF, negativní ionizace.
• M/z rozsah: 60–1000; režim ESI(-).
• Parametry plynů a zdrojů: teplota pláště 200 °C, teplota sheath plynu 300 °C, sheath flow 12 L/min, gas flow 10 L/min, nebulizace 40 psi; kapilára −3000 V, nozzle 0 V.
• Software: MassHunter Quant 12.2 pro kvantifikaci; MassHunter Explorer 2.0 pro nestrukturovanou analýzu a PCA.

Hlavní výsledky a diskuse

Chromatografie a separace:

• HILIC metoda na Altura sloupci zajistila dobré rozlišení aminokyselin včetně separace izomerů leucinu a iso­leucinu.
• Injekce standardů (n=4) ukázaly vysokou opakovatelnost a konzistentní retence mezi injekcemi.

Kvantifikace a analytické výkony:

• Kalibrační křivky pokryly široký dynamický rozsah (obvykle 50–50 000 nM; některé analyty měřeny od 50 nM do 50 µM). Pro většinu sloučenin byla dosažena vynikající linearita (R2 > 0,998) a relativní standardní odchylky < 10 %.
• Mass accuracy byla velmi dobrá (< 2 ppm), což podporuje selektivní kvantifikaci v komplexní matrici.

Sledování fermentace:

• Mnohé aminokyseliny vykazovaly výrazné snížení koncentrace v průběhu fermentace; mezi nejvíce depletované patřily valin, prolin, tryptofan, fenylalanin, isoleucin a leucin.
• Startovní koncentrace aminokyselin v médiu byly kvantifikovány (např. alanin ~136 µM, glutamát ~71 µM, leucin ~63 µM; nižší: glycin ~1.7 µM, methionin ~1.5 µM).
• Metodika umožnila paralelní sledování spotřeby hexózy a vzniku fermentačních vedlejších produktů (např. mléčná kyselina) díky volbě vysokého pH mobilní fáze a negativní ionizaci.

Datová analýza:

• PCA založená na MassHunter Explorer ukázala časovou dynamiku celkového metabolitového profilu během fermentace, oddělující časové body a naznačující významné změny metabolického stavu kultury.

Přínosy a praktické využití metody

• Analýza bez derivatizace: zkrácení doby přípravy vzorku a snížení možných interferencí či ztrát při derivatizaci.
• Bio‑inertní HILIC sloupec je vhodný pro biologické matrixy bohaté na proteiny a lipidy, minimalizuje adsorpci a zlepšuje reprodukovatelnost.
• Široký dynamický rozsah a vysoká přesnost hmotnostního měření umožňují kvantifikaci aminokyselin v různých koncentracích bez nutnosti rozsáhlých ředicích postupů.
• Současné sledování aminokyselin, sacharidů a organických kyselin usnadňuje celkovou monitoraci fermentačního děje pro účely optimalizace procesu nebo kontroly kvality.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace tohoto LC/TOF workflow do online/near‑line monitoringu fermentorů pro rychlé rozhodování v reálném čase.
• Rozšíření panelu analyzovaných metabolitů kombinací cílené kvantifikace s nestrukturovanou metabolomikou pro komplexní profilování bioprocesů.
• Automatizace přípravy vzorků a normalizace pomocí izotopově značených interních standardů pro zlepšení přesnosti v rutinních provozních podmínkách.
• Aplikace na jiné mikroorganismy, komerční bioprocesy a potravinářské fermentace s adaptací kalibrací a vzorkovacích schémat.
• Vývoj datových nástrojů pro rychlou interpretaci časových řad a predikci výkonnosti kultury na základě metabolitových trendů.

Závěr

Popsaný workflow spojující bio‑inertní Altura HILIC sloupec, bio‑kompatibilní LC a Agilent 6230C TOF poskytuje spolehlivou a citlivou metodu pro kvantifikaci nederivovaných aminokyselin v komplexním fermentačním médiu. Metoda nabízí dobré chromatografické rozlišení (včetně izomerů), široký dynamický rozsah, vysokou reprodukovatelnost a možnost současného sledování organických kyselin a sacharidů. To ji činí užitečnou pro monitorování fermentací v potravinářství, biotechnologii i výzkumu.

Reference

1. Maicas S. The Role of Yeasts in Fermentation Processes. Microorganisms. 2020;8(8):1142.
2. Hsiao J. et al. Pushing the Boundaries of Chromatographic Separation with Inert HPLC Column Hardware. Agilent White Paper 5994-8618EN. 2025.
3. Hsiao J. et al. Analysis of Underivatized Amino Acids by LC/MS for Bioreactor Cell Culture Monitoring. Agilent Application Note 5991-8816EN. 2018.