Down in the Weeds: Automated Fast Screening Workflow for Cannabinoids in Whole Blood Using High Resolution Mass Spectrometry

Význam tématu

Sérologické stanovení kanabinoidů v celkové krvi je pro forenzní toxikologii klíčové pro rozlišení psychoaktivních látek (zejména izomerů THC) od nepsychoaktivních izobarů a nově vznikajících semi‑syntetických kanabinoidů (např. HHC). Schopnost rychlého screeningu s možností důvěryhodného následného potvrzení zvyšuje průchodnost laboratoře a současně snižuje riziko falešně pozitivních nebo nedostatečně rozlišených výsledků. Retrospektivní vyhodnocení dat z vysokorozlišující hmotnostní spektrometrie navíc umožňuje identifikovat nové nebo dosud nepředpokládané látky v uchovaných datech.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo nasadit a otestovat automatizovaný dvoustupňový chromatograficko‑MS workflow na platformě Revident LC/Q‑TOF spojené s 1290 Infinity II LC pro rychlý screening kanabinoidů v celkové krvi a pro automatické „reflexní“ přeanalýzování podezřelých vzorků pomocí specifické chromatografie k odlišení izobar a izomerů. Hlavní požadavky byly vysoká propustnost (rychlý první průchod), spolehlivé rozlišení izomerů (dlouhý druhý průchod) a možnost retrospektivní analýzy pomocí All Ions akvizice.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorkování a příprava vzorků:

• 500 µL celkové krve jako vstupní množství.
• Proteiny precipitovány přidáním 1,2 mL studeného ACN:MeOH (85:15, v/v), vortex, centrifugace.
• Supernatant filtrován přes Captiva EMR‑Lipid kazetu s aplikací pozitivního tlaku pro odstranění lipidů a interferencí.
• Eluát vysušen pod dusíkem při 45 °C a rekonstituován v 100 µL MeOH:H2O (50:50, v/v).

Chromatografie a MS:

• Instrumentace: Revident LC/Q‑TOF v kombinaci s 1290 Infinity II LC (Agilent).
• Rychlý screening (MS‑only): C18 kolona, doba běhu ~4 minuty, pozitivní ionizační režim; metoda navržena tak, aby minimalizovala přesah matrice do retenčních časů analytů.
• Druhý průchod (reflexní): Poroshell 120 PFP kolona s delší chromatografií (~15 minut) optimalizovanou pro baseline separaci THC izomerů i jejich hydroxy‑ a karboxy‑metabolitů; akvizice v režimu All Ions pro fragmentační data a retrospektivní vyhledávání.
• Testované rozsahy: 1–500 ng/mL, příklad kalibračního rozsahu delta‑8 THC 5–500 ng/mL.

Hlavní výsledky a diskuse

Workflow a automatizace:

• Implementace inteligentní reflexní logiky umožnila automatické doplnění podezřelých vzorků buď ihned zařazením do pracovního listu nebo append režimem na jeho konec; metoda v experimentu používala append režim pro vyšší efektivitu.
• Před reinjekcí reflexní logika vkládá prázdný běh pro přechod metody a ekvilibraci kolony, variabilně lze vkládat i kontrolní QC vzorky.

Výkon analytického postupu:

• Metoda prokázala dobrou citlivost, linearitu a reprodukovatelnost pro všechny sledované anality.
• Limit kvantifikace (LOQ) byl pro většinu sloučenin 5 ng/mL; pro HHC byl LOQ stanoven na 10 ng/mL.
• Na základě doporučení SWGTOX a interního ověření byl stanoven cutoff 10 ng/mL pro vyvolání reflexní reinjekce.
• Krátká první metoda byla cíleně projektována tak, aby separovala hlavní matrix interferenty od analytů, čímž se minimalizoval počet falešně pozitivních reflexí do delší metody.
• Druhá dlouhá metoda (All Ions) poskytuje baseline separaci THC izomerů a dovoluje pozorovat fragmenty pro potvrzení identity, včetně rozlišení d8/d9 izomerů a jejich hydroxy‑/karboxy‑metabolitů.

Přínosy a praktické využití metody

• Výrazné zvýšení propustnosti laboratoře díky krátké 4minutové první fázi a reflexní strategii, kdy pouze vzorky nad prahovou hodnotou podléhají detailnímu 15minu přezkumu.
• Snížení nákladů a spotřeby provozních zdrojů (reagenčních i časových) oproti režimu, kdy by se všechny vzorky analyzovaly druhou, delší metodou.
• Vysoká jistota identifikace díky kombinaci cíleného chromatografického rozlišení a vysokorozlišující MS akvizice s možností fragmentační validace.
• Schopnost retrospektivního zpracování dat ve formě All Ions akvizice umožňuje detekovat nově objevené nebo neočekávané kanabinoidy v dříve nahraných datech bez opětovného měření vzorků.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření knihoven a workflow pro rychlé zahrnutí nových semi‑syntetických kanabinoidů a izomerů do automatického screeningu s využitím retrospektivní analýzy.
• Integrace pokročilých rozhodovacích algoritmů (strojové učení) pro adaptivní úpravu cutoffů nebo předpověď pravděpodobnosti falešných pozitiv na základě chromatografických a spektrálních vzorců.
• Další miniaturizace a zrychlení přípravy vzorků, případně přechod na 96‑well nebo plně automatizované přípravné stanice pro zvýšení throughputu v rutinních forenzních laboratořích.
• Využití All Ions akvizice pro neustálou aktualizaci retrospektivních vyhledávacích strategií a rychlé mapování populačních trendů v užívání nových kanabinoidů.

Závěr

Prezentované dvoustupňové řešení kombinuje rychlý MS‑only screening s inteligentní reflexní reinjekcí na delší chromatografii a poskytuje efektivní kompromis mezi throughputem a analytickou jistotou. Metoda dosahuje nízkých LOQ (většinou 5 ng/mL), reprodukovatelnosti a schopnosti rozlišit kritické THC izomery v komplexním matrici krve. Retrospektivní možnosti vysokorozlišující MS rozšiřují užitnou hodnotu dat pro sledování nových látek na trhu. Tento přístup je vhodný pro forenzní a toxikologická pracoviště, která potřebují rychlý screening s možností spolehlivého následného potvrzení.

Reference

1. Stevens J., Zhao L. Efficient Quantitative Analysis of THC and its Metabolites in Whole Blood Using Agilent Captiva EMR‑Lipid and LC‑MS/MS. Agilent Application Note 5991‑8635EN, 2020.
2. Stone PJW et al. Quantitative Separation of THC Isomers and Metabolites from Whole Blood. Agilent Application Note 5994‑8664EN, 2025.