Separating and Identifying Site-Specific Isomeric Amino Acids in GLP-1 Receptor Agonists on the Cyclic™ IMS P20 Mass Spectrometer

Separace a lokalizace izomerických aminokyselin v GLP-1 receptor agonistech pomocí Cyclic IMS P20

Význam tématu:
Peptidová léčiva, jako jsou GLP-1 receptor agonisté, vyžadují detailní profilování nečistot, protože i stereochemické varianty (např. D‑aminokyseliny nebo isoaspartát) nemění hmotnost, ale mohou ovlivnit stabilitu, biologickou aktivitu a imunogenicitu. Konvenční LC–MS často selhává při rozlišení těchto izomerů; proto je důležité zavést orthogonální separační a strukturální přístupy, které umožní detekci a lokalizaci nízkoúrovňových izomerických nečistot.

Cíle a přehled studie / článku:
Cílem bylo demonstrovat workflow kombinující reverzní fázi LC, vysokorozlišovací cyklickou iontovou mobilitu (Cyclic IMS) a hmotnostní spektrometrii (MS) pro separaci a lokalizaci izomerických aminokyselin v liraglutidu. Studie ukazuje, že multipass IMS rozliší koelující izomery, zatímco pre‑IMS fragmentace a analýza mobility produktních iontů umožní lokalizovat místo izomerizace (konkrétně D‑Ser u pozic 8 a 11). Dále je v pracovním postupu použita Wideband Enhancement (WBE) pro zvýšení citlivosti produktních iontů.

Použitá metodika a instrumentace:
Metoda (stručně):

• Vzorek: liraglutide standard v 10 µg/mL, připraven ve vodě, použity vials s MaxPeak HPS pro snížení nespecifické adsorpce.
• Chromatografie: ACQUITY Premier UPLC, kolona ACQUITY UPLC Peptide BEH C18 2.1 x 100 mm, 1.7 µm, 130 Å; teplota kolony 45 °C, teplota vzorku 8 °C, průtok 0.3 mL/min, injekce 10 µL. Gradienty optimalizovány (24 min vs. 60 min) pro zlepšení chromatografické separace.
• Hmotová spektrometrie a IMS: Waters Cyclic IMS P20 Mass Spectrometer v módu Sensitivity, pozitivní ionizace, m/z 50–4000, sken 0.3 s; zdroj 100 °C, desolvatace 550 °C, kapilára 2.0 kV, cone 40 V, trap CE 45 eV.
• Fragmentace: pre‑IMS CID a volitelně ECD provedené před cyklickým IMS pro generování b/y a c/z iontů; následná separace produktních iontů v IMS a porovnání ATD (arrival time distributions) mezi hlavním produktem a izomery.
• Wideband Enhancement (WBE): použití WBE pro zvýšení signálu produktních iontů napříč širokým m/z rozsahem, zlepšení tvaru špiček a izotopové věrnosti, typicky ~6× zvýšení intenzity vybraných iontů.

Použitá instrumentace:

• Waters Cyclic IMS P20 Mass Spectrometer (s možností multipass IMS, pre‑IMS CID/ECD a WBE).
• Waters ACQUITY Premier UPLC System (binary).
• ACQUITY UPLC Peptide BEH C18 kolona, 2.1 x 100 mm, 1.7 µm, 130 Å.
• Waters QuanRecovery™ Vials with MaxPeak™ High Performance Surfaces (HPS) 12 x 32 mm.

Hlavní výsledky a diskuse:

• Detekce více izomerických forem: Standardní 24minutový gradient LC–MS vykázal minoritní izomerický signál, který IMS rozložil do dvou složek (Iso1 a Iso2, ~0.24% a 0.61%).
• Využití delšího gradientu a single‑pass IMS zlepšilo chromatografickou detekci, avšak až vysokorozlišovací multipass Cyclic IMS (až 8 průchodů) odhalil třetí velmi nízko intenzitní izomer (Iso3, ~0.09%), který byl při jednopřejezdu neviditelný.
• Pre‑IMS fragmentace a analýza mobility produktních iontů: díky umístění kvadrupólu před IMS bylo možné provést skutečný MS/MS (CID nebo ECD) před průchodem mobility separátorem. Porovnáním ATD u párů fragmentních iontů mezi hlavní formou a izomery bylo možné lokalizovat místo izomerizace — u Iso1 byly rozdíly v ATD konzistentní s D‑serinem na pozici 8, u Iso2 zase s D‑serinem na pozici 11.
• Role WBE: WBE významně zvýšilo intenzitu a tvar produktních iontů (uvedeno přibližně 6násobné zvýšení u vybraného iontu 1554 m/z), čímž umožnilo spolehlivou analýzu ATD i u nízkoúrovňových fragmentů a tím zvýšilo důvěru v lokalizaci izomerizace.
• Konsistence výsledků: kombinace CID a ECD poskytla komplementární sadu b/y a c/z iontů, čímž se zvýšila robustnost přiřazení lokalizace izomerického znění aminokyseliny.

Přínosy a praktické využití metody:

• Rozšíření standardního LC–MS workflow o cyklickou IMS a pre‑IMS fragmentaci přináší orthogonální selektivitu schopnou rozlišit izomerické nečistoty, které jinak zůstávají skryté.
• Možnost lokalizace izomerizace na úrovni pozice zvyšuje informativnost impurity profilingu a může zjednodušit následné kroky validace, syntézy nebo formulace.
• WBE zlepšuje citlivost pro nízkoabundantní produktní ionty, což je kritické pro spolehlivou interpretaci ATD u stopových izomerů.
• Metoda je relevantní pro kontrolu kvality u syntetických peptidů (výroba, stabilita, formulace) a může snížit potřebu časově a materiálně náročných doplňkových analýz.

Budoucí trendy a možnosti využití:

• Sledování izomerizací napříč širším spektrem terapeutických peptidů a proteomických studií, včetně aplikací v kontroly stability a degradace léčivých přípravků.
• Integrace IMS‑řízených workflow do regulačních a QA/QC procedur pro rutinní detekci stereochemických variant a nízkoúrovňových nečistot.
• Další vylepšení citlivosti a rozlišovací schopnosti pomocí optimalizace WBE, vyššího počtu průchodů IMS nebo kombinace s orthogonálními fragmentačními technikami a softwarem pro automatizované porovnávání ATD.
• Rozvoj databází arrival time distribucí a softwarových nástrojů pro automatickou lokalizaci modifikací/izomerizací na základě fragment‑level IMS dat.

Závěr:
Studie ukazuje, že kombinace LC, multiple‑pass Cyclic IMS, pre‑IMS fragmentace (CID/ECD) a WBE vytváří výkonný analytický nástroj pro separaci a lokalizaci izomerických aminokyselin v peptidech. Pro liraglutide tato platforma odhalila tři izomerické formy, přičemž dva z nich byly lokalizovány na specifické serinové pozice (8 a 11). Přístup zvyšuje schopnost detekovat a charakterizovat nízkoúrovňové stereochemické nečistoty, čímž přispívá ke kvalitnějšímu profilování peptidových léčiv a efektivnějším rozhodnutím v rámci vývoje a kontroly kvality.

Reference:

1. Mattingly TJ, Duru EE, Conti RM. Adverse events administering glucagon-like peptide-1 receptor agonists: a cross-sectional study. Health Aff Sch. 2026;4(2):qxag023. doi:10.1093/haschl/qxag023
2. Peri RV, Anchan H, Jonnalagadda K, Varghese R, Gupta P. Designing GLP-1 delivery: structural perspectives and formulation approaches for optimized therapy. Nutrition & Diabetes. 2025;15(1):53. doi:10.1038/s41387-025-00397-4
3. Jones K. Tools and Techniques for GLP-1 Analysis. June 9, 2025.
4. Jones K. Analytical Challenges and Emerging Strategies for GLP-1 Analysis. LCGC International. October 31, 2025.
5. Zhang B, Xu W, Yin C, Tang Y. Characterization of low-level D-amino acid isomeric impurities of Semaglutide using liquid chromatography-high resolution tandem mass spectrometry. J Pharm Biomed Anal. 2023;224:115164. doi:10.1016/j.jpba.2022.115164
6. De Groot AS, et al. Immunogenicity risk assessment of synthetic peptide drugs and their impurities. Drug Discov Today. 2023;28(10):103714. doi:10.1016/j.drudis.2023.103714
7. Dodds JN, Baker ES. Ion Mobility Spectrometry: Fundamental Concepts, Instrumentation, Applications, and the Road Ahead. J Am Soc Mass Spectrom. 2019;30(11):2185-2195. doi:10.1007/s13361-019-02288-2