BOOSTING SENSITIVITY IN TOP-DOWN PROTEIN STUDIES USING CYCLIC IMS-ENABLED WIDEBAND ENHANCEMENT

Význam tématu

Top-down proteomika poskytuje přímou sekvenční informaci o intactních proteinech včetně jejich posttranslačních modifikací, což je klíčové pro strukturální biochemii, biologii proteinů a kvalitativní kontrolu v biotechnologiích. Hlavní limitací MS/MS režimů v top-down přístupech je nízká citlivost při rozkladu intenzity předkurzorových iontů do mnoha produktových iontů, dále pak rozložení signálu přes více nábojových stavů a široké izotopové distribuce. Zvýšení citlivosti bez kompromisu rozlišení zlepšuje schopnost detekovat slabé fragmenty, rozlišit izoformy a zvýšit pokrytí sekvence, zejména u velkých proteinů a u méně efektivních fragmentačních technik jako ECD.

Cíle a přehled studie

Cílem předložené práce bylo demonstrovat novou implementaci Wideband Enhancement (WBE) na Cyclic IMS P20 hmotnostním spektrometru a prokázat, že WBE výrazně zvyšuje citlivost MS/MS pro top-down analýzy proteinů napříč celým hmotnostním rozsahem. Studie porovnává režimy s WBE a bez WBE, s využitím jak kolizní aktivované disociace (CID), tak elektronové zachycování disociace (ECD), včetně režimů průchodu iontovou mobilitou (single-pass) i průchodu obcházením (bypass).

Použitá metodika

Analýza byla provedena za denaturačních podmínek na dvou standardních proteinech: bovinní ubiquitin (~8,5 kDa) a bovinní carbonic anhydrase II (~29 kDa). Vzorky byly infundovány přímo v pozitivním ESI režimu. Pro každý protein byly zaznamenány experimenty s jednoprochodovou iontovou mobilitou (0,98 m cyklické travelling-wave zařízení) i s obcházením, a to za použití CID i ECD fragmentace. WBE bylo aplikováno tak, že synchronizovalo odchod iontových paketů z IMS se sekvencí pusherů v TOF, čímž maximalizovalo duty cycle pro definovaný rozsah m/z.

Použitá instrumentace

• Cyclic IMS P20 Mass Spectrometer (Waters) s možností škálovatelné iontové mobility.
• Integrovaná ECD bunka pro elektronově založenou disociaci.
• Režimy měření: pozitivní ESI, přímá infuze.
• Softwarové zpracování: MassLynx v4.2, vizualizace DriftScope, workflow waters_connect a UNIFI peptide mapping.

Hlavní výsledky a diskuse

• WBE princip: synchronizace odcházejících iontových paketů z IMS s TOF pusherem výrazně zvyšuje počet iontů dopadajících na detektor (duty cycle) pro zvolený m/z rozsah, aniž by se snížilo rozlišení.
• Citlivostní zlepšení až do 10× pozorováno pro produktové ionty v MS/MS u ubiquitinu; typicky byly nízké m/z fragmenty zesíleny až 10× a vysoké m/z fragmenty až 8× v porovnání s režimem bez WBE.
• U carbonic anhydrase II vedlo použití WBE v bypass režimu ECD k nárůstu pokrytí sekvence z 54 % na 70 % (absolutní zlepšení ~15 %), což dokládá významné zvýšení citlivosti pro méně efektivní ECD procesy.
• Největší boost citlivosti byl dosažen při kombinaci WBE s bypass IMS, což indikuje, že minimalizace separace v IMS může maximalizovat synchronizaci a tím dostupné iontové proudy pro TOF detekci.
• Data ukázala zlepšení S/N i lepší tvar peaků (př. fragment m/z 1553,39), což podporuje lepší kvantifikaci a interpretaci fragmentačních spekter.
• DriftScope analýza ukázala jasnou segmentaci arrival time vs m/z prostoru při WBE, což umožňuje efektivní selekci a zvýšení intenzity produktových iontů napříč kategoriemi izotopů a nábojů.

Přínosy a praktické využití metody

• Zvýšená citlivost MS/MS umožňuje detekci slabých a vzdálených fragmentů, zlepšuje identifikaci PTM a rozlišování izoform u intactních proteinů.
• WBE výrazně zvyšuje praktický výkon ECD, čímž rozšiřuje využitelnost ECD pro velké proteiny, kde je ECD běžně méně účinné než CID.
• Metoda je kompatibilní s kombinací komplementárních fragmentačních technik (CID + ECD) a škálovatelné iontové mobility, což přispívá k ucelenému strukturálnímu charakteru analýzy.
• Ve variantě bypass může WBE poskytovat výrazný nárůst citlivosti tam, kde je prioritou maximální počet iontů do MS/MS bez rozsáhlé kapilární separace v IMS.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace WBE do rutinních top-down protokolů v biologických a farmaceutických laboratořích může urychlit charakterizaci proteomických vzorků s nízkou dostupností materiálu.
• Další optimalizace synchronizace WBE pro širší m/z pásma a adaptivní řízení pusher sekvence by mohly zlepšit pokrytí i u extrémně velkých proteinů a komplexů.
• Kombinace WBE s front-end chromatografií nebo více stupňů iontové mobility by mohla umožnit selektivní zesílení cílových frakčních pásů bez ztráty separační informace.
• Rozvoj datových analýz a algoritmů, které plně využijí zvýšenou hustotu fragmentačních dat (např. z ECD), podpoří automatizované mapování modifikací a lepší kvantitativní inference.

Závěr

Wideband Enhancement na Cyclic IMS P20 představuje účinný přístup k zvýšení citlivosti top-down MS/MS analýz bez zhoršení rozlišení. Metoda přináší až desetinásobné zvýšení intenzity fragmentů, významně zlepšuje výkon ECD a zvyšuje sekvenční pokrytí u proteinů střední velikosti (ukázáno pro carbonic anhydrase II). Kombinace WBE s komplementárními fragmentačními technikami a škálovatelnou iontovou mobilitou poskytuje robustní platformu pro detailní strukturální charakterizaci intactních proteinů včetně detekce PTM a izoform.

Reference

1. Cui W, Rohrs HW, Gross ML. Top-down mass spectrometry: Recent developments, applications and perspectives. Analyst. 2011;136(19):3854-3864.
2. Hoang C, Uritboonthai W, Hoang L, et al. Tandem Mass Spectrometry across Platforms. Anal Chem. 2024;96(14):5478-5488.