Demonstrating Inertness for the Analysis of Nucleotides on the Agilent 1290 Infinity II Bio LC

Význam tématu

Inertnost kapalinové chromatografie je zásadní pro spolehlivou analýzu metal-citlivých sloučenin, zejména nukleotidů a fosfátových derivátů. Nepředvídané adsorpce na kovových površích vede k deformaci piků, snížené citlivosti a nesprávné kvantifikaci.

Cíle a přehled studie

Cílem této studie bylo demonstrovat inertnost systému Agilent 1290 Infinity II Bio LC při analýze ekvimolárního směsi adenosinu a adenosinového diphosfátového analogonu AMPcP. Pomocí vyhodnocení poměru ploch piků se ověřila nízká adsorpce na kovových komponentech průtokové cesty.

Použitá metodika a instrumentace

Analýza proběhla za následujících chromatografických podmínek:

• Kolona: ACQUITY PREMIER HSS T3, 1,8 µm, 2,1 × 50 mm
• Mobilní fáze A: 10 mM octan amonný ve vodě; B: 90 % acetonitril + 10 % voda, 10 mM octan amonný, 0,1 % TFA
• Gradient: 0 min 5 % B → 3 min 95 % B; doba běhu 3 min; post time 5 min
• Průtok 0,4 mL/min; teplota 35 °C; vlnová délka detekce 260 nm; injekce 1 µL
• Vstřikovací teplota 10 °C, jehla vyplach 3 s vodou; detekce UV s mikroprůtokovou kyvetou 2 µL
• Instrumentace: Agilent 1290 Infinity II Bio LC (Pumpa G7131A, Multisampler G7137A, Multicolumn Thermostat G7116B, Detektor G7114B) a software OpenLab CDS 2.6

Hlavní výsledky a diskuse

Pět po sobě jdoucích analýz testovací směsi prokázalo stabilní retenční časy i plochy piků. Relativní odchylka RSD pro retenční časy byla <0,1 % a pro plochy pod 0,5 % u AMPcP i adenosinu. Poměr ploch AMPcP/Adenosin dosáhl průměrně 0,95 ± 0,01, což dokazujе minimální adsorpci nukleotidu na kovové části.

Přínosy a praktické využití metody

Potvrzená inertnost systému Agilent 1290 Infinity II Bio LC umožňuje vysoce přesnou a reprodukovatelnou analýzu fosfátových biomolekul bez rizika sample loss. Metoda je vhodná pro farmaceutický výzkum, QA/QC i biochromatografii, kde je klíčová integrita analyzovaných látek.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj může směřovat k aplikacím na proteiny a peptidy s fosforylací, integraci s hmotnostní spektrometrií pro vícesložkové analýzy a nasazení v automatizovaných vysokopropustných platformách. Optimalizace materiálů průtokové cesty a rozšíření kompatibility na extrémní pH či vysoký obsah solí podpoří širší využití.

Závěr

Systém Agilent 1290 Infinity II Bio LC s MP35N komponentami prokázal vynikající inertnost a stabilní výkon při analýze nukleotidů. Díky minimálnímu adsorpčnímu efektu a vysoké reprodukovatelnosti je doporučen pro analýzy kov-citlivých fosfátových sloučenin.

Reference

• Wakamatsu A. et al. A Severe Peak Tailing of Phosphate Compounds Caused by Interaction with Stainless Steel Used for Liquid Chromatography and Electrospray Mass Spectrometry. Mass Spectrometry Applications in Separation Sciences 2005, 28(14), 1823–1830.
• Fekete S. Defining Material Used in Biopharmaceutical Analysis. LCGC Europe 2021, 34(6), 245–248.
• Schneider S. Comparability Studies for the Analysis of Nucleotides on Four Different LC Systems. Agilent Technologies application note 5994–4392EN, 2021.
• Patel A. et al. PREMIER Standards to Investigate the Inertness of Chromatographic Surfaces. Waters Corporation application note 720007105EN, 2021.