Unlocking the immunopeptidome - High-sensitivity and accurate mass spectrometry with the Orbitrap Astral Zoom mass spectrometer for superior antigen characterization

Význam tématu

Imunopeptidomika se zabývá identifikací peptidů vázaných na molekuly MHC/HLA na povrchu buněk, které jsou klíčové pro rozpoznání buněk T-lymfocyty. Přímá identifikace těchto peptidů hmotnostní spektrometrií umožňuje objevení tumor-specifických antigenů (TSAs) a podporuje personalizované imunoterapie a vývoj vakcín. Analytická výzva spočívá v nízké abundanci, variabilní délce a absenci standardních enzymatických štěpných míst u HLA-peptidů, což vyžaduje maximální citlivost, šířku dynamického rozsahu a vysokou kvalitativní přesnost spekter.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem technické poznámky bylo vyhodnotit hloubku pokrytí a kvalitu identifikací imunopeptidomu při použití data-dependent acquisition (DDA) na Orbitrap Astral Zoom mass spectrometru. Studie porovnávala citlivost a schopnost detekovat jak singulárně nabité, tak více nabité peptidy při různých zatíženích vzorku (ekvivalenty buněk 1e5 až 1e8) a s použitím více hodnot FAIMS offsetu pro maximalizaci pokrytí.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorek: HLA třídy I peptidové komplexy byly imunoprecipitovány z lidské IM-9 B-lymfocytární linie (výchozí kultury odpovídající 1e8 buněk) pomocí pan-specifické protilátky W6/32; peptidy byly eluovány, vysušeny a resuspendovány v 3 % acetonitrilu/5 % kyseliny mravenčí. Pro zajištění porovnatelnosti byly do LC-MS injektovány objemy odpovídající nábojům 1e5, 1e6, 1e7 a 1e8 buněčných ekvivalentů.
Použitá instrumentace:

• Orbitrap Astral Zoom mass spectrometer s Low Input aplikací a předakumulací iontů (bent trap)
• Thermo Scientific FAIMS Pro Duo rozhraní (např. CVs -20 V, -45 V, -60 V)
• Thermo Scientific EasySpray ion source
• Thermo Scientific Vanquish Neo UHPLC (pumpa/autosampler)
• IonOpticks Aurora Ultimate XT 25 × 75 C18 kolona s ohřevem
• AssayMap Bravo automatizovaný systém pro obohacení peptidů
• PEAKS Studio 12 s DeepNovo Peptidome workflow a MHCMotifDecon 1.2 pro predikci motivů

Hlavní provozní parametry (shrnutí):

• Full scan v režimu Orbitrap, rozlišení 120 000, rozsah m/z 350–1 500 (pro některé experimenty 700–1 500)
• MS2 (Astral) rozsah 110–1 500 m/z, HCD kolize energie ~28 %, maximální injekční čas 100 ms
• AGC řízení pro automatické přizpůsobení akumulace iontů; volitelná pre-akumulace v bent trap pro zvýšení citlivosti
• Trojnásobné FAIMS CV nastavení: -20 V (umožňuje inkluzi jednokladně nabitých iontů) a -45 / -60 V pro více-nabité ionty
• LC: přímá injekce, průtok 0,2 µL/min, kolona 25 cm, teplota 50 °C, gradient optimalizovaný pro nízkonosičové vstupy

Hlavní výsledky a diskuse

• Počet identifikovaných peptidů rostl s vyšším zatížením: průměrně ~9 006 (1e5), 16 574 (1e6), 26 971 (1e7) a 27 553 (1e8) peptidů (n=3 pro všechny kromě 1e8, kde byl pouze jeden resp.).
• Podíl jednokladně nabitých peptidů se pohyboval mezi ~13 % až 47 % v závislosti na zatížení, což odráží biochemii HLA-peptidů (často bez zásaditých zbytků). Použití FAIMS (-20 V) umožnilo účinně detekovat tyto singulární ionty, zatímco -45/-60 V zabíraly více-nabité peptidy.
• Většina identifikovaných peptidů měla délku 8–9 aminokyselin, což odpovídá očekávanému profilu HLA třídy I; 9mer peptidy vykazovaly typické vazebné motivy a detekovaly se různé alely HLA (včetně častého výskytu HLA-A02:05 v analyzovaném vzorku).
• Spektrální kvalita zůstala konzistentní napříč zatíženími: fragmentační série b a y iontů byly dobře pokryty i při nízkých vstupech, což podporuje spolehlivou de novo sekvenaci neznámých peptidů.
• Široký dynamický rozsah detekce dosahoval až sedmi řádů velikosti, což je důležité pro zachycení peptidů s velmi nízkou abundancí (potenciální neoantigeny).
• Kvantitativní linearita mezi zatíženími byla velmi vysoká (R2 ≈ 0,9997), což ukazuje, že systém zachovává kvantitativní proporcionalitu napříč rozsahy vzorků.
• Hodnocení kvality spekter v PEAKS Studio 12 ukázalo, že většina MS2 korelačních skóre přesahovala 0,7, tedy vysokou shodu mezi naměřeným a predikovaným spektrem.

Diskuse: Kombinace Low Input módu, předakumulace iontů a FAIMS signifikantně rozšiřuje schopnost Astral Zoom MS detekovat jak singulární, tak více-nabité HLA peptidy z omezeného materiálu, což přímo zvyšuje šanci na nalezení relevantních neoantigenů z klinických biopsií.

Přínosy a praktické využití metody

• Mimořádná citlivost pro nízkonosičové vzorky: umožňuje analýzu vzorků odpovídajících biopsiím nebo jiným vzácným zdrojům materiálu (od 1e5 buněčných ekv.).
• Inkluze jednokladně nabitých peptidů rozšiřuje detekovatelné spektrum HLApeptidů, které by jinak mohly uniknout při metodách orientovaných pouze na více-nabité ionty.
• Vysoká spektrální kvalita a konzistence (AGC, pre-akumulace) podporují spolehlivou de novo identifikaci mutovaných či nekonvenčních peptidů.
• Široký dynamický rozsah a kvantitativní linearita umožňují jak objevné studie (neoantigen discovery), tak kvantitativní monitorování cílených peptidů při vývoji terapeutik či biomarkerů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další integrace s pokročilými bioinformatickými pipeline pro rychlejší a citlivější objevy neoantigenů (strojové učení pro lepší spektrální predikce a prioritizaci kandidátů).
• Rozvoj standardizovaných protokolů pro klinickou translační aplikaci imunopeptidomiky, včetně validace workflow pro malý objem biopsií.
• Možné rozšíření na single-cell nebo near-single-cell přístupy, pokud pokročí separace/akumulace iontů a zvýší se výtěžnost izolace HLA komplexů.
• Kombinování s analýzou posttranslačních modifikací a nekanonických zdrojů peptidů (např. neoantigeny z alternativních čtecích rámců nebo non-coding regionů).
• Vylepšení FAIMS strategií a rychlosti akvizice pro vyšší průchodnost při zachování citlivosti.

Závěr

Použití Orbitrap Astral Zoom MS v kombinaci s FAIMS Pro Duo, Low Input módem, předakumulací iontů a optimalizovaným UHPLC workflow poskytuje vysokou citlivost, široký dynamický rozsah a konzistentní spektrální kvalitu potřebnou pro hloubkovou immunopeptidomiku. Tento přístup je vhodný pro detekci vzácných HLA peptidů, podporuje de novo identifikaci neoantigenů a rozšiřuje možnosti analýzy vzácných klinických vzorků.

Reference

1. Kaabinejadian S., Barra C., Alvarez B., Yari H., Hildebrand W., Nielsen M. Accurate MHC motif deconvolution of immunopeptidomics data reveals high relevant contribution of DRB3, 4 and 5 to the total DR immunopeptidome. Frontiers in Immunology. 26 January 2022. DOI: 10.3389/fimmu.2022.835454