Optimized quantitative XL-MS Analysis on an Orbitrap Tribrid Apex mass spectrometer

Význam tématu

Cross-linking mass spectrometry (XL-MS) umožňuje mapovat prostorové uspořádání proteinů a interakční sítě na proteomové úrovni, což je klíčové pro pochopení komplexních biologických procesů a strukturálních změn v buňkách. Kvantitativní XL-MS s izobarickými značkami (TMT) přidává dimenzi změn v abundanci komplexů a kontaktů mezi podmínkami, avšak je technologicky náročný kvůli nízké intenzitě reporter iontů a potřebě vysoké citlivosti a rychlosti měření. Optimalizace HW i SW částí workflow proto zásadně rozšiřuje použitelnost metody v rutinních i výzkumných aplikacích.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo optimalizovat kvantitativní XL-MS workflow založené na MS-štěpném crosslinkeru DSSO a TMT11plex značkování na novém Orbitrap Tribrid Apex hmotnostním spektrometru tak, aby se maximalizovala intenzita TMT reporter iontů, snížil počet chybějících kanálů a zvýšil počet kvantifikovatelných crosslinků. Studie porovnávala různé akviziční strategie (MS2-MS2 vs MS2-MS3), režimy aktivace (HCD vs IRMPD), nastavení FAIMS a parametry řízení AGC/injekčního času a následně hodnotila identifikace a kvantifikaci dat pomocí softwaru Proteome Discoverer s XlinkX nodem.

Použitá metodika a instrumentace

• Crosslinker: DSSO (disuccinimidyl sulfoxide) použitý pro in vitro i in-cell (HEK293) crosslinking.
• Multiplexní kvantifikace: TMT11plex pro relativní kvantifikaci crosslinkovaných vzorků.
• Chromatografie: Thermo Scientific Vanquish Neo LC se segmentem Optispray PepMap Neo 75 µm × 50 cm, gradienty 1–3 hodin pro separaci crosslinkovaných peptidů.
• Hmotnostní spektrometrie: Thermo Scientific Orbitrap Tribrid Apex s OptiSpray ion source; měření probíhala s a bez FAIMS (filtrace podle kompenzačního napětí) pro redukci komplexity spekter.
• Aktivační režimy: srovnání klasického HCD a IRMPD (infrared multiphoton dissociation). Použitá FAIMS CV hodnoty zahrnovaly například -50, -60, -70 V pro optimalizaci selekce iontů.
• Akviziční strategie: optimalizována MS2 rychlost, AGC target, maximální injekční časy, izolační šířky, normalized collision energy a rozlišení (MS1 typicky vysoké rozlišení ~120 000 pro lepší přesnost). Byly testovány režimy MS2-MS2 a MS2-MS3 pro analýzu DSSO crosslinků s TMT kvantifikací.
• Software a analýza dat: Thermo Scientific Proteome Discoverer verze 3.3 SP1 s XlinkX nodem pro identifikaci crosslinkovaných peptidů (XL open search) a Sequest nodem pro neošetřené, looplinky a monolinky. Vyhledávání proti lidské proteinové databázi; statická modifikace karbamidomethylace Cys, proměnné modifikace včetně oxidace Met a specifických modifikací při crosslinkingu. FDR nastaveno na 1 % na úrovni CSM a cross-linků.
• Vizualizace: výsledné sítě a interakce vizualizovány v Cytoscape.

Hlavní výsledky a diskuse

• Výrazné zvýšení intenzity TMT reporter iontů: použitím nového IR laseru (IRMPD) byla pozorována až trojnásobná zvýšení signálu reporter iontů ve srovnání s tradičními HCD přístupy. Toto zvýšení vede k menšímu počtu chybějících kanálů a robustnějšímu kvantitativnímu pokrytí.
• Vyšší počet kvantifikovatelných crosslinků: díky optimalizovanému paralelnímu řízení doby injekce iontů (parallel ion injection) a vyladěným akvizičním parametrům přístroj umožnil detekovat podstatně více crosslinků, které lze kvantifikovat napříč TMT kanály.
• Porovnání akvizičních strategií: kombinace MS2-MS3 s vhodným nastavením aktivace (IRMPD pro uvolnění reporterů) zlepšila spolehlivost kvantifikace oproti klasickému MS2-MS2 režimu, zvláště u komplexních vzorků. Nicméně volba režimu může být závislá na konkrétním vzorku a prioritách mezi identifikací a kvantifikací.
• FAIMS optimalizace: nasazení FAIMS s vícenásobnými CV zvýšilo selektivitu a snížilo pozadí, čímž se zlepšilo poměr signál/šum u crosslinkovaných peptidů; přitom bylo nutné vyvážit počet CV kroků proti celkové době analýzy.
• Datová analýza: použití XlinkX v Proteome Discoverer umožnilo efektivní hledání DSSO-specifických štěpených produktů i interpretaci kombinovaných MS2/MS3 spekter; nastavení FDR na 1 % zajistilo přijatelnou úroveň jistoty identifikací.

Přínosy a praktické využití metody

• Vyšší citlivost a lepší kvantifikace umožňují aplikace XL-MS pro porovnávání stavů buněk či podmínek (např. léčba vs kontrola) na proteomové úrovni.
• Robustnější TMT čtení snižuje počet chybějících kanálů a zvyšuje důvěru v relativní kvantifikaci interakcí a kontaktů mezi proteiny.
• Optimalizované workflow lze aplikovat v strukturální biologii, farmakologii (mapování působení léků na komplexní interakce), kvalitativních testech komplexních komplexů a při integraci s modelováním struktur proteinů.
• FAIMS a IRMPD představují efektivní nástroje pro zvýšení selektivity a reporter signálu v náročných proteomových vzorcích.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další vývoj instrumentace: zvýšení paralelizace akvizice, rychlejší a citlivější detektory a integrace nových laserových nebo elektronových aktivačních metod pro lepší uvolnění reporter iontů.
• Vylepšení crosslinkerů: nové štěpné a izobarické crosslinkery optimalizované pro konkrétní aktivační režimy a vyšší multiplexování (TMTpro) zvýší rozsah a hloubku kvantitativních studií.
• Softwarové nástroje a AI: pokročilé algoritmy pro dekonvoluci komplexních spekter, strojové učení pro filtrování falešných pozitiv a lepší integrace XL-MS dat s 3D modelováním (např. kombinace s cryo-EM a predikcemi struktur) zvýší interpretační sílu výsledků.
• In-cell a native XL-MS: rozvoj protokolů pro crosslinking v živých buňkách a zachování nativních interakcí rozšíří biologické aplikace metody.
• Širší adopce FAIMS/ion mobility technik: kombinace separace v plynu a optimalizované akvizice může nadále zlepšit citlivost a selektivitu pro nízkohmotnostní a nízkostavové crosslinkované peptidy.

Závěr

Optimalizace kvantitativního XL-MS workflow na Orbitrap Tribrid Apex přinesla zásadní zlepšení v intenzitě TMT reporter iontů (až trojnásobné) a ve schopnosti kvantifikovat větší počet crosslinků v komplexních proteomových vzorcích. Klíčovými faktory úspěchu byly nasazení IRMPD pro lepší uvolnění TMT reporterů, vyladěné parametry akvizice (AGC, injekční časy, rozlišení) a využití FAIMS pro snížení spektrálního pozadí. Výsledné workflow zvyšuje spolehlivost a použitelnost kvantitativního XL-MS pro aplikace v strukturální proteomice, mapování interakcí a farmakologickém výzkumu.

Reference

1. Kao A, Chiu CL, Vellucci D, Yang Y, Patel VR, Guan S, Randall A, Baldi P, Rychnovsky SD, Huang L. Development of a novel cross-linking strategy for fast and accurate identification of cross-linked peptides of protein complexes. Mol Cell Proteomics. 2011 Jan;10(1):M110.002212.
2. Shannon P, Markiel A, Ozier O, Baliga NS, Wang JT, Ramage D, Amin N, Schwikowski B, Ideker T. Cytoscape: a software environment for integrated models of biomolecular interaction networks. Genome Res. 2003 Nov;13(11):2498-504.