Liquid chromatography – high-resolution mass spectrometry method for determination of NDSRI in six beta-blocker drug substances

Význam tématu

Nitrosaminy a konkrétně nitrosaminové nečistoty vázané na léčivou látku (NDSRI) představují v současné farmaceutické praxi významné riziko vzhledem ke svému karcinogennímu potenciálu a častým nálezům v dávkových formách. Systematická, citlivá a selektivní analytika NDSRI v surových API je klíčová pro splnění regulačních požadavků (FDA, EMEA) a pro prevenci stažení léčiv z trhu. Metody založené na tekuté chromatografii spojené s vysokým rozlišením hmotnostní spektrometrie (LC-HRMS) nabízejí vysokou přesnost hmotnosti a selektivitu nutnou k rozlišení NDSRI od isobarických interferencí a strukturně podobných matricových komponent.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem publikovaného aplikačního poznámky bylo vyvinout univerzální, spolehlivou a kvantitativní LC‑HRMS metodu pro stanovení jedné skupiny NDSRI příslušné ke šesti betablokátorům (atenolol, bisoprolol fumarát, carvedilol, labetalol HCl, metoprolol fumarát, propranolol HCl). Metoda měla být rychlá (runtime 20 min), robustní, citlivá na úrovně definované pomocí CPCA/AI (Carcinogenic Potency Categorization Approach / Acceptable Intake) a použitelná pro různé API s adekvátní chromatografickou separací a spolehlivou selekcí produktových iontů.

Použitá metodika a instrumentace

Metoda kombinuje UHPLC separaci s vysokým rozlišením Orbitrap hmotnostní spektrometrie a zahrnuje následující přístrojová a provozní kritéria:

• UHPLC: Thermo Scientific Vanquish Flex Binary UHPLC; kolona Hypersil GOLD C18 Selectivity 3 × 100 mm, 3 μm; teplota 40 °C; průtok 0,4 mL/min.
• Mobilní fáze: 0,1 % kyseliny mravenčí ve vodě (A) a v methanolu (B) se gradientem 20 minut navrženým pro dobré rozlišení API vs. NDSRI.
• Detekce: Thermo Scientific Orbitrap Exploris 120 HRMS v pozit. režimu H‑ESI; rozlišení Orbitrap 120 000; produktové iontové (tandem) skeny optimalizované pro každé NDSRI; nastavení iontového zdroje (spray 3 500 V, teploty ion transfer a aux heater ~275–300 °C).
• Softwarové nástroje: Chromeleon CDS pro akvizici a zpracování dat; Mass Frontier pro teoretickou fragmentaci a výběr produktových iontů.
• Příprava vzorků: 50:50 methanol:voda jako diluent; standardní zásobní roztoky 100 μg/mL; příprava vzorků API v koncentracích odpovídajících specifikačním limitům (obvykle 2–10 mg/mL dle API), filtrace 0,2 μm PVDF.

V textu studie jsou specifikovány individuální injekční objemy a divert‑ventil, který směřuje tok na MS během retenčních oken analytu a jinak do odpadu/UV pro snížení kontaminace MS.

Použitá instrumentace

• Vanquish Flex UHPLC (System Base, Binary Pump F, Split Sampler FT, Column Compartment H, Diode Array Detector FG)
• Hypersil GOLD C18 Selectivity kolona, 3 × 100 mm, 3 μm
• Orbitrap Exploris 120 high‑resolution mass spectrometer
• Chromeleon CDS (verze 7.3.2) a Mass Frontier 8.0 SR2
• Další spotřební materiál: LC/MS grade methanol, voda, formic acid; 0,2 μm PVDF filtry; laboratorní centrifugy, injekční microvials apod.

Hlavní výsledky a diskuse

Klíčová zjištění metody jsou:

• Chromatografie: Metoda dosáhla spolehlivé chromatografické separace NDSRI od odpovídajícího API během 20 minut pomocí zvoleného gradientu a kolony. UV chromatogramy a MS XIC prokázaly čisté vrcholy pro standardy i vzorky API.
• Senzitivita: LOQ bylo stanoveno jako 10 % specifikačního limitu (v souladu s regulačními požadavky) a LOD jako přibližně 1/3 LOQ. Minimální S/N v LOD byl velmi dobrý (nejnižší pozorované S/N = 102), což ukazuje na vysokou citlivost HRMS při zpracování s přesností hmotnosti na 5 desetinných míst.
• Lineární rozsah a linearita: Kalibrační křivky byly lineární v rozmezí 10–350 % specifikační úrovně; koeficient determinace R2 > 0,99 pro všechny analyty.
• Reprodukovatelnost a robustnost: Reprodukovatelnost (šesti replik) při specifikační úrovni vykázala maximální %RSD kolem 2.7 % (u jednotlivých NDSRI). Dlouhodobá robustnost včetně bracketing standardů po sekvenci až 21 hodin vykázala maximální kumulativní %RSD 6.4 %.
• Objev aduktů a volba iontů: U některých NDSRI se vyskytovaly různé adukty ([M+H]+, [M+NH4]+, [M+Na]+, [M+K]+). Pro spolehlivé kvantifikace byla proto zvolena produktová iontová akvizice (tMS2) s potvrzenými produktovými ionty podle Mass Frontier; to minimalizovalo interferující izobarické signály.
• Ion‑ratio confirmation: Poměry kvalifikačních a kvantifikačních iontů byly ověřeny dle kritérií (EC Decision 2002/657/EC) a potvrdily identitu pro všechny analyty v rámci tolerancí.
• Recovery: Extrakční výtěžnost a přesnost ve spikovaných API byla v rozmezí přibližně 77–107 %, tedy v přijatelných mezích 70–130 %.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda přináší několik praktických výhod:

• Univerzální přístup: jedna LC‑HRMS metoda je použitelná pro šest různých betablokátorových API a jejich NDSRI, což zjednodušuje validaci a rutinní kontrolu v QA/QC laboratořích.
• Vysoká selektivita: použití Orbitrap HRMS s vysokou přesností hmotnosti a produktovými ionty snižuje riziko falešně pozitivních nálezů z isobarických interferencí.
• Rozumný runtime: 20minutový gradient dává kompromis mezi kapacitou throughput a chromatografickou separací.
• Sledovatelnost a datová integrita: použití Chromeleon CDS umožňuje kompletní auditní stopu, řízení uživatelů a reprodukovatelné reportování.

Budoucí trendy a možnosti využití

Předpokládané směry dalšího rozvoje a aplikace metody:

• Rozšíření aplikovatelnosti: adaptace workflow na další skupiny API a jejich specifické NDSRI, případně multiplexní analýzy více NDSRI v jednom běhu.
• Standardizace a harmonizace: sdílení validovaných postupů mezi laboratořemi pro zlepšení mezinárodní porovnatelnosti výsledků a rychlejší implementace regulačních požadavků.
• Využití stabilně značených interních standardů: zavedení izotopově značených interních standardů pro lepší korekci matice a zvýšení přesnosti kvantifikace při nízkých hladinách.
• Automatizace přípravy vzorků a data‑processing: integrace robotizace extrakcí a pokročilých algoritmů pro dekonvoluci spekter ke zvýšení throughput a snížení lidské chyby.
• Pokročilé HRMS režimy: využití širších možností HRMS (např. zadní přesná kalibrace, ion mobility v kombinaci s HRMS) pro další zvýšení selektivity a rozlišení isomerů/interferencí.

Závěr

Vyvinutá LC‑HRMS metoda na platformě Vanquish Flex U HPLC / Orbitrap Exploris 120 prokázala schopnost kvantifikovat NDSRI v šesti betablokátorových API s vysokou citlivostí, dobrou reprodukovatelností a robustností. Metoda splňuje klíčové validační parametry: linearita (R2 > 0,99), LOQ definované jako 10 % specifikační úrovně s vynikajícím S/N, LOD ≈ 1/3 LOQ, přijatelné recovery a ion‑ratio potvrzení identity. Díky těmto vlastnostem je metoda vhodná pro rutinní kontrolu API v souladu s aktuálními regulačními doporučeními.

Reference

• Recommended acceptable intake limits for nitrosamine drug substance related impurities (NDSRIs) guidance for industry. FDA, 2023.
• Nitrosamine drug substance‑related impurities (NDSRIs). European Pharmaceutical Review, přehledová publikace.
• Nitrosamine impurities. European Medicines Agency – aktualizované vedení k N‑nitrosaminům.
• Validation parameters of analytical method. Přehled rozdílů ve validaci ICH/FDA.
• ICH Q2(R2) Validation of analytical procedures – Scientific guideline. European Medicines Agency.
• European Commission Decision 2002/657/EC – pravidla pro potvrzování a interpretaci analytických výsledků.
• Liquid chromatography‑high resolution mass spectrometry (LC‑HRMS) method for the determination of six nitrosamine impurities in ARB drugs. FDA application note.
• Nitrosamine exchange community. USP iniciativa pro výměnu informací o nitrosaminech.