Analytical Characterization of GLP-1 Agonists: Sequence Confirmation by Q-TOF MS/MS

Význam tématu

Peptidová léčiva, zvláště GLP-1 agonisté, představují rostoucí třídu terapeutik s vysokou selektivitou cílových receptorů. Přesná verifikace primární sekvence a identifikace modifikací (např. nekanonické zbytky, acylace) jsou zásadní pro zajištění identity, konzistence šarží a bezpečnosti produktu. Vysoce přesná MS/MS charakterizace umožňuje odhalit i drobné změny v sekvenci, které mohou zásadně ovlivnit biologickou aktivitu, a je proto klíčová pro vývoj i kontrolu kvality peptidových léčiv.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo ověřit schopnost LC/Q-TOF MS/MS workflow (Agilent Revident) poskytovat kompletní potvrzení sekvence u tří reprezentativních GLP-1 agonistů: retatrutide, tirzepatide a liraglutide. Studie testovala, zda vysoké rozlišení a MS/MS fragmentace vedou k jednoznačnému pokrytí celé primární struktury včetně oblastí s nekanonickými zbytky a dlouhořetěznými acylacemi.

Použitá metodika

Vzorky: komerčně dodané standardy retatrutide, tirzepatide a liraglutide; skladování a ředění dle výrobce. Připraveny v DMSO (2,0 mg/mL) a následně zředěny do 1 mg/mL ve vodě.
Chromatografie: reverzní peptidová kolona (Altura Peptide Plus, 2.1 × 150 mm, 2.7 µm), gradientní eluční metoda 22 min, mobilní fáze A 0,1 % kyselina formová / voda, B 0,1 % kyselina formová / acetonitril; průtok 0,4 mL/min, teplota kolony ~55 °C, objem injekce 0,4 µL.
MS/MS akvizice: pozitivní ESI (dual AJS), rozsah m/z 100–3 200 (MS) a 50–3 200 (MS/MS), vysoká frekvence snímání (5 spekter/s MS, 3 spektra/s MS/MS), úzká izolační šířka ~1,3 m/z, nastavená závislost kolizní energie na m/z, aktivní vyloučení a výběr až 5 prekurzorů na cyklus. Data zpracována v Agilent MassHunter BioConfirm pro automatizované mapování b/y iontových řad a skórování shody.

Použitá instrumentace

• Agilent 1290 Infinity II LC system (pumpa, autosampler, multicolumn thermostat)
• Kolona: Altura Peptide Plus, 2.1 × 150 mm, 2.7 µm
• Agilent Revident LC/Q-TOF (G6575A) s dual AJS ESI
• Software: MassHunter Data Acquisition for LC/TOF & LC/Q-TOF v12.0; MassHunter BioConfirm v12.1

Hlavní výsledky a diskuse

Obecné výsledky: Pro všechny tři testované GLP‑1 agonisty byla dosažena 100% pokrytí primární sekvence díky bohatým a dobře rozloženým b a y iontovým sadám. MS/MS spektra vykazovala vysokou intenzitu signálu a konzistentní fragmentační vzory vhodné pro jednoznačnou identifikaci zbytků v celé délce peptidů.
Retatrutide: 39místný, silně modifikovaný triple-agonista s nekanonickými zbytky (Aib na pozicích 2 a 20, α‑methyl‑Leu na pozici 13) a C20 diacidovou acylací na lysinu (pozice 17). Navzdory prolin‑bohatému C‑konci přístroj vygeneroval 38 y a 37 b iontů (M+H)+ a kompletní sekvenční pokrytí; BioConfirm skóre ~25 ukázalo vysokou jistotu identifikace. Pozorováno bylo dobré fragmentační chování i v oblastech sousedících s proliny a modifikacemi, což naznačuje rovnoměrnou distribuci energie při CID a efektivní štěpení páteře peptidu.
Tirzepatide: podobně 39‑aminokyselinový lineární peptid s Aib modifikacemi a C20 acylací; získáno 38 y a 36 b iontů s 100% pokrytím a vysokou kvalitou spekter (BioConfirm skóre ~25). Výsledek potvrzuje schopnost platformy zvládat prolin‑bohaté sekvence a modifikované pozice, kde bývá CID méně efektivní.
Liraglutide: 31‑aminokyselinový analog s C16 acylací na specifickém lysinu; získáno 29 b a 29 y iontů, opět s kompletním pokrytím a vysokou signálovou intenzitou (BioConfirm skóre ~25).
Diskuse: Konsistentní vysoké skóre a úplné b/y iontové série dokládají, že moderní Q‑TOF MS/MS workflow efektivně potvrzuje složité peptidové sekvence včetně nekanonických zbytků a lipidických modifikací. Zvlášť důležité je spolehlivé mapování oblastí obsahujících proliny a chemické modifikace, které obvykle snižují CID fragmentaci; v této práci byla tato omezení výrazně potlačena kvalitní instrumentací a optimalizovanou akvizicí.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká jistota identifikace sekvence: kompletní pokrytí a bohaté b/y iontové řady umožňují jednoznačné potvrzení primární struktury peptidů.
• Schopnost analyzovat modifikované peptidy: metoda zvládá nekanonické zbytky a lipidické acylace bez ztráty sekvenční schopnosti.
• Podpora QC a regulace: vhodné pro kontrolu identity, konzistence mezi šaržemi a detekci nežádoucích změn během vývoje či skladování.
• Efektivní software: BioConfirm zjednodušuje interpretaci MS/MS dat a poskytuje kvantifikovatelná skóre důvěryhodnosti.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření fragmentačních režimů: kombinace CID s alternativními přístupy (ETD, EThcD) může dále zlepšit mapování post‑translačních a nekanonických modifikací.
• Automatizace a vysokopropustné workflow: integrace s robustními LC systémy a softwarem pro zpracování umožní rutinní QC většího počtu šarží.
• Pokročilá datová analýza: využití algoritmů strojového učení pro lepší odlišení izomerů, detekci stopových nečistot a predikci biologického dopadu modifikací.
• Top‑down a middle‑down přístupy: komplementární strategie k bottom‑up (MS/MS peptidů) pro úplnější charakterizaci vyšších řádů struktury a stavů modifikací.
• Analýza složitých multi‑agonistů: jak rostou více‑cílové peptidové projekty, bude potřeba robustních metod pro separaci a sekvenční potvrzení kombinovaných modifikací.

Závěr

Studie ukazuje, že LC/Q‑TOF MS/MS workflow s Agilent Revident přístrojem a BioConfirm softwarem poskytuje opakovatelnou, vysoce kvalitní sekvenční charakterizaci GLP‑1 agonistů. Pro všechny tři testované peptidy byla dosažena 100% pokrytí primární sekvence a bohaté b/y iontové sady, i v přítomnosti nekanonických zbytků a dlouhých acylací. Metoda je vhodná pro nároční analytický monitoring v průběhu vývoje a pro rutinní QC peptidových léčiv.

Reference

1. Malovichko G.; Zhu X. Single Amino Acid Substitution in the Vicinity of a Receptor‑Binding Domain Changes Protein–Peptide Binding Affinity. ACS Omega. 2017, 2, 5445–5452. doi: 10.1021/acsomega.7b00963
2. Melson E.; et al. What Is the Pipeline for Future Medications for Obesity? International Journal of Obesity (London). 2025, 49(3), 433–451. doi: 10.1038/s41366-024-01473-y