Ion-Pair-Free Reversed-Phase LC/MS Analysis of siRNA Using a Single Quadrupole Mass Spectrometer

Význam tématu

Analýza oligonukleotidů, především siRNA, je klíčová pro vývoj a kontrolu kvality nových oligonukleotidových léčiv. Schopnost přesně potvrdit molekulovou hmotnost a identifikovat jednotlivé sekvence bez potřeby iontově párovacích činidel snižuje riziko kontaminace instrumentace a umožňuje širší využití běžných LC/MS systémů v rutině výzkumu a QC.

Cíle a přehled studie

Cílem prezentované studie bylo ukázat možnost potvrzení molekulové hmotnosti dvouvláknového siRNA bez použití iontově párovacích reagenčních systémů. Autoři demonstrovali ion-pair-free reverzní fázovou chromatografii v kombinaci se single quadrupole hmotnostním spektrometrem (LCMS-2050) a softwarovou podporu LabSolutions Insight Biologics pro nastavení a identifikaci více sekvencí současně.

Použitá instrumentace

Seznam hlavních přístrojů a modulů použitých v práci:

• Nexera XS inert UHPLC (Shimadzu)
• LCMS-2050 single quadrupole mass spectrometer se zahřívaným DUIS ion source (kombinace ESI/APCI)
• Shim-pack Scepter Claris C18-300 kolona (50 mm x 2.1 mm I.D., 1.9 µm)
• LabSolutions Insight Biologics software pro konfiguraci sekvencí a analýzu výsledků

Použitá metodika

Analýza byla prováděna reverzní fázovou LC bez iontově párujících alkylaminů; mobilní fáze obsahovala 10 mM hydrogenuhličitanu amonného v bližší fázi A a methanol jako fázi B. Gradient přecházel z 2 % B do 40 % během 5 minut, poté k 90 % a zpět. Tok byl 0,4 mL/min, injekční objem 1 µL a teplota kolony testována převážně při 60 °C (rovněž zmíněna 25 °C).

Hmotnostní spektrometr pracoval v pozitivním režimu s DUIS ionizací (ESI/APCI), skenoval rozsah m/z 800–2000, nastavena byla detekce vícenásobně nabitých iontů (zaznamenané náboje 4+ až 6+). Parametry plynů a teplot zahrnovaly: nebulizační plyn 2.0 L/min, sušící plyn 5.0 L/min, topný plyn 7.0 L/min, desolvation temp. 450 °C a DL temp. 200 °C.

Vzorky

Jako model byly použity dvouvláknové siRNA odvozené ze sekvence Patisiranu se standardními chemickými modifikacemi (2'-deoxy a 5-methyl). Zkoumány byly jak sense, tak antisense vlákna po dissociaci do jednovláknového stavu.

Hlavní výsledky a diskuse

Hlavní experimentální zjištění:

• UV chromatogramy ukázaly dvě vratké hlavní vlny nezávisle na teplotě pece, což je interpretováno jako separace dvojvláknového siRNA na samostatné sense a antisense řetězce.
• Software LabSolutions Insight Biologics umožnil nastavení cílových sekvencí a automatickou identifikaci komponent na základě MS1 spektra, včetně zohlednění různých nábojových stavů a izotopů.
• Molekulové hmotnosti obou jednořetězcových komponent byly potvrzeny s chybou menší než 1 Da vůči teoretickým hodnotám, přičemž byly detekovány vícenásobně nabité ionty (4+ až 6+), což umožnilo adekvátní přesnost i na single quadrupole přístroji.

Diskuse zmiňuje, že využití hydrogenuhličitanu amonného jako volby mobilní fáze spolu s DUIS ionizací dovolilo získat dostatečný signál bez potřeby iontově párujících alkylaminů. To eliminuje nutnost vyčlenění instrumentu pouze pro ion-pair metody a snižuje riziko kontaminace, která by mohla ovlivnit jiné typy analýz.

Přínosy a praktické využití metody

Praktické výhody přístupu popsaného ve studii:

• Snížení rizika kontaminace instrumentů typické pro iontově párovací metody a menší nároky na údržbu.
• Možnost provádět hmotnostní potvzení oligonukleotidů na standardním single quadrupole LC/MS vybavení, což zvyšuje dostupnost metody v běžných laboratořích.
• Softwarová podpora pro simultánní nastavení a identifikaci více sekvencí zvyšuje efektivitu analýzy a usnadňuje rutinní kontrolu remnantních sekvencí nebo produktů degradace.

Budoucí trendy a možnosti využití

Možnosti dalšího rozvoje a aplikací této strategie zahrnují:

• Rozšíření na různé typy oligonukleotidů včetně konjugátů (např. GalNAc) a kratších či delších RNA fragmentů bez nutnosti iontově párujících činidel.
• Integrace s vyšším rozlišením hmotnostních analyzátorů pro detailní mapování modifikací a izobarických variant, kdy single quadrupole slouží jako rychlý screeningový nástroj.
• Optimalizace mobilních fází a gradientů pro lepší retenci a rozlišení specifických modifikací nebo konjugátů.
• Využití v kontrolách kvality průmyslové výroby oligonukleotidových léčiv, kde je rychlé potvrzení molekulové hmotnosti kritické.

Závěr

Studie prokázala, že ion-pair-free reverzní fázová LC/MS metoda na single quadrupole systému LCMS-2050 umožňuje potvrdit molekulovou hmotnost siRNA s vysokou přesností (chyba <1 Da) a identifikovat dissociované sense a antisense řetězce. Kombinace hydrogenuhličitanu amonného v mobilní fázi a DUIS ionizace poskytla dostatečný signál bez použití alkylaminů, což zlepšuje praktičnost a univerzálnost metody v laboratorní praxi.

Reference

Uvedené související aplikace a zdroje uvedené v původním dokumentu:

1. Ion-Pair Reversed-Phase LC/MS Analysis of GalNAc-siRNA Conjugates under Denaturing and Non-Denaturing Conditions. Application News No. 01-01177-EN
2. Reversed-Phase Ion-Pair LC/MS Analysis of siRNA under Denaturing and Non-Denaturing Conditions. Application News No. 01-00915-EN
3. Efficient Method Development for Separation of Capped mRNA Fragments. Application News No. 01-00898-EN

Acknowledgments: Studie byla podpořena AMED (Grant Numbers JP21ae0121022, JP21ae0121023, JP21ae0121024; project leader Satoshi Obika).