Characterization of GalNAc-siRNA Conjugates Using a Quadrupole Time-of-Flight Mass Spectrometer

Charakterizace GalNAc-siRNA konjugátů pomocí kvadrupólového časově-of-letového hmotnostního spektrometru (Q-TOF)

Význam tématu

Oligonukleotidové terapie, zejména antisense a siRNA, nabývají významu v léčbě genetických a obtížně léčitelných onemocnění. Konjugace s N-acetylgalaktosaminem (GalNAc) umožňuje cílenou dodávku do jater prostřednictvím vazby na ASGPR receptor, přičemž triantennární GalNAc (Tri-GalNAc) je často používán pro zvýšení účinnosti internelizace. Spolehlivá analytika těchto konjugátů (hmotnostní identifikace, potrvzení sekvence a modifikací) je kritická pro vývoj, kontrolu kvality a registraci léčiv.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo demonstrovat použití ion-pair reverzní fázové LC/MS s Q-TOF (LCMS-9050) a softwarem LabSolutions Insight Biologics pro: potvrzení molekulové hmotnosti, rozdělení a identifikaci jednotlivých vláken dvouvláknového siRNA konjugovaného Tri-GalNAC, a sekvenační potvrzení pomocí MS/MS. Studie ukazuje nastavení analýzy, vizualizaci výsledků a schopnost analyzovat více sekvencí současně.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika

• Separace: ion-pair reverzní fázová UHPLC za denaturačních podmínek (60 °C) k rozdělení dvouvláknového siRNA na sense a antisense vlákno.
• Ionizace: ESI v negativním režimu; MS1 pro potvrzení molekulární hmotnosti; DDA MS/MS pro fragmentační sekvenování.
• Software: LabSolutions Insight Biologics pro konfiguraci sekvencí, kalkulaci monoisotopické hmotnosti, zobrazení struktury a vizualizaci pokrytí sekvence (branch a fill režimy).

Použitá instrumentace

• UHPLC: Nexera XS inert.
• Kolona: Shim-pack Scepter Claris C18-300, 100 × 2.1 mm, 1.9 µm.
• Fáze: mobilní fáze A = 50 mM HFIP + 5 mM TEA ve vodě; mobilní fáze B = methanol; gradient 10 % B (0 min) → 50 % (10 min) → 90 % (10.01–12 min) → 10 % (12.1–20 min).
• Proudění: 0.3 mL/min; teplota kolony 60 °C; injekční objem 2 µL.
• MS: LCMS-9050 Q-TOF; rozsahy MS1 m/z 550–2500, MS/MS m/z 100–2500; ESI negativní; plyny: nebulizace 3.0 L/min, drying 10.0 L/min, heating 10.0 L/min; teploty: interface 350 °C, DL 250 °C, block heater 400 °C.

Vzorky

Testovaný materiál byl dvouvláknové siRNA odvozené od sekvence givosiranu, obsahující běžné syntetické modifikace: 2'-O-methoxy, 2'-deoxy-2'-fluoro, fosforotioátové vazby a Tri-GalNAc navázaný jako 3'-terminální modifikace sense vlákna.

Hlavní výsledky a diskuse

• Separace a chromatografie: při 60 °C došlo k denaturaci a rozdělení duplexního siRNA na samostatné sense a antisense špičky viditelné v UV chromatogramu při 260 nm.
• Potvrzení molekulové hmotnosti: LC/MS umožnila získat komponentní chromatogramy a dekonvolvované spektrum více nabitých iontů pro každé vlákno, což vedlo k jednoznačnému potvrzení teoretických hmotností modifikovaných oligonukleotidů.
• Sekvenační analýza MS/MS: řízené rozbití a analýza fragmentů poskytly identifikaci fragmentních iontů napříč celé délce obou vláken. Software vizualizoval 100% pokrytí sekvence pro sense i antisense vlákno, včetně fragmentů zahrnujících GalNAc-modifikaci.
• Softwarová podpora: LabSolutions Insight Biologics umožnila souběžné nastavení a analýzu více sekvencí, uložení parametrů a snadnou interpretaci dat (zobrazení monoisotopické hmotnosti, strukturálního schématu a mapy pokrytí sekvence ve dvou režimech: branch a fill).

Přínosy a praktické využití metody

• Komplexní charakterizace: kombinace ion-pair RP-UHPLC a Q-TOF MS umožňuje zároveň separaci, potvrzení molekulové hmotnosti a sekvenční diagnostiku modifikovaných siRNA.
• Podpora vývoje a kontroly kvality: metoda je vhodná pro vývoj formulací, kontrolu identity substancí a pro rutinní QC krok v produkčním procesu oligonukleotidů.
• Flexibilita analýzy: software dovoluje definovat různé nukleotidové modifikace, linkery a přídavné skupiny, což usnadňuje analýzu různorodých terapeutických oligonukleotidů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření na nativní a nedenaturační podmínky pro studium komplexů a agregací oligonukleotidů a jejich vazebných partnerů.
• Optimalizace ion-pair reagensů a gradientů pro lepší rozlišení izomerů a aduktů, případně přechod k alternativním metodám separace kompatibilním s MS (např. HILIC, kapilární elektroforéza-MS).
• Využití vyššího rozlišení a citlivosti nových Q-TOF nebo orbitrap systémů pro detekci nízkoabundantních degradantů a nečistot.
• Automatizace workflow a integrace s bioinformatikou pro rychlou validaci sekvencí a sledování post-translačních či chemických modifikací v režimu vysokopropustných analýz.
• Nasazení v regulačních postupech a standardizovaných QC protokolech pro klinickou výrobu oligonukleotidových léčiv.

Závěr

Studie demonstrovala, že ion-pair reverzní fázová LC/MS s Q-TOF (LCMS-9050) v kombinaci se specializovaným softwarem (LabSolutions Insight Biologics) poskytuje spolehlivou platformu pro identifikaci, potvrzení hmotnosti a sekvenční charakterizaci GalNAc-konjugovaných siRNA. Metoda umožňuje vizuální a kvantitativní ověření pokrytí sekvence včetně modifikací a podporuje analýzu více sekvencí současně, což je cenné pro vývoj a QC oligonukleotidových terapeutik.

Reference

1. Nakazono, J. Characterization of GalNAc-siRNA Conjugates Using a Quadrupole Time-of-Flight Mass Spectrometer. Shimadzu Application News, First Edition Apr 2026, Application No. 01-01176-EN.
2. Related Application Notes: Ion-Pair Reversed-Phase LC/MS Analysis of GalNAc-siRNA Conjugates under Denaturing and Non-Denaturing Conditions (01-01177-EN); Ion-Pair Reversed-Phase LC/MS Analysis of siRNA under Denaturing and Non-Denaturing Conditions (01-00915-EN); Efficient Method Development for Separation of Capped mRNA Fragments (01-00898-EN).
3. Acknowledgment: Studie byla finančně podporována AMED granty JP21ae0121022, JP21ae0121023 a JP21ae0121024.