Antibody-Drug Conjugate (ADC) Analysis with the Agilent ProteoAnalyzer System

Význam tématu

CE-SDS analýza antibody-drug conjugates (ADC) je klíčová pro kontrolu kvality a vývoj cílených biologických léčiv. Heterogenita (např. distribuce náložení, pozice vazby, vznik kovalentních crosslinků) přímo ovlivňuje účinnost, bezpečnost a stabilitu ADC. V praxi je potřeba rychlých, reprodukovatelných a vysoce rozlišovacích analytických metod pro monitorování těchto kritických atributů během vývoje i výrobního procesu.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem application note bylo demonstrovat schopnosti systému Agilent ProteoAnalyzer při CE-SDS analýze ADC. Studie ukazuje, jak systém rozlišuje velikostní varianty a konformační fragmenty u cysteinových i lysinových konjugací, vyhodnocuje přesnost a opakovatelnost sizingu a kvantifikace a ilustruje kombinaci redukovaných a neredukovaných podmínek pro komplexní charakterizaci.

Použitá metodika a instrumentace

• Systém: Agilent ProteoAnalyzer (současná konfigurace umožňuje paralelní separaci až 12 kapilár).
• Kit: Agilent Protein Broad Range P240 kit (p/n 5191-6640), použitý s lower marker (LM) only metodikou; pro sizing neredukovaných vzorků importován NIST mAb jako velikostní žebřík.
• Vzorky: SigmaMab Antibody Standard (MSQC4-1MG), SigmaMab ADC Mimic (MSQC8-0.5MG), Trastuzumab, Trastuzumab deruxtecan, Trastuzumab emtansine (T-DM1).
• Příprava vzorků: rekonsitituce na 10 mg/mL a ředění na 1,5 mg/mL v nuclease-free vodě; koncentrace kontrolována NanoDrop (Protein A280, extinction coeff. 14.3); vzorky zpracovány v redukovaných i neredukovaných podmínkách, značení reagenční sadou při 70 °C po dobu 10 minut.
• Pro neredukované injekční podmínky optimalizace: snížení injekčního napětí na 7 kV a doba 6 s pro lepší rozlišení.
• Analýzy: redukované a neredukované CE-SDS pro identifikaci LC/HC a vyšších fragmentů, sizing pomocí importovaného žebříku, kvantifikace plochy píků pro výpočet relativních složek a přibližného DAR distribučního profilu.

Hlavní výsledky a diskuse

• Cysteinové konjugace: redukované CE-SDS typicky zobrazilo LC a HC a v řadě případů částečné rozlišení LC bez a s jedním payloadem (L0 vs L1). Neredukované podmínky umožnily rozeznat různá interchain fragmenta (L, H, HL, HH, HHL, HHLL) a tím i poziční izomery podle změn v poměru a velikosti píků. Příklady: SigmaMab ADC Mimic vykazoval rozdělení LC do tří píků (různé pozice payloadu) a Trastuzumab deruxtecan vykazoval navýšení signálu pro určité L a H fragmenty.
• Reprodukovatelnost: sizingová přesnost u replik byla vysoká (sizing < 2,5 % CV) a kvantifikační přesnost lepší než ~10 % CV, což je vhodné pro rutinní QC analýzy.
• Lysinové konjugace (příklad T-DM1): neredukovaný profil často velmi podobný necílenému mAb, což umožňuje spolehlivé hodnocení monomerické čistoty. Při redukci se však objevily vysoce-molekulární „impurity“ (~75–125 kDa), které naznačují vznik nedisulfidových kovalentních crosslinků mezi řetězci během výroby. Dále byla poznamenána analytická omezení: pokud jsou všechny lysiny obsazeny payloadem, fluorescenční značení může být omezené a senzitivita detekce klesá.
• Omezení rozlišení: v některých případech (např. derivatizovaný trastuzumab deruxtecan v redukovaných podmínkách) systém nerozlišil konjugovanou formu od nekonjugované zcela jednoznačně, přesto umožnil kvantifikaci a sizing jednotlivých fragmentů. Doporučuje se kombinovat CE-SDS s technikami jako HIC či MS pro kompletní určení DAR a lokalizace payloadu.
• DAR: u T-DM1 bylo uvedeno rozpětí DAR 0–8 s průměrem přibližně 3,5; ProteoAnalyzer v kombinaci s dalšími technikami (HIC/MS) je použitelný pro určení průměrného DAR a distribuce náložení.

Přínosy a praktické využití metody

• CE-SDS na ProteoAnalyzeru poskytuje rychlou, automatizovanou a vysoce reprodukovatelnou platformu pro sizing a kvantifikaci ADC fragmentů pod oběma podmínkami (redukované/nereukované).
• Metoda je vhodná pro kontrolu monomerické čistoty, sledování vzniku crosslinků a distribuce velikostních variant, což je zásadní v průmyslové QC a při vývoji formulací.
• Schopnost paralelního běhu až 12 kapilár a použití kalibračních žebříků (např. NIST mAb) zvyšuje throughput a přesnost sizingu kompenzující migraci závislou na sekundární struktuře.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace CE-SDS výsledků s HIC a MS pro komplexní profilování DAR, identifikaci pozičních izomerů a přesné určení pozice payloadu bude směr pro úplnou charakterizaci ADC.
• Zlepšení značení a detekčních strategií pro lysinově konjugované ADC (aby se minimalizoval vliv saturace lysinů) a vývoj alternativních konjugací, které umožní spolehlivější detekci.
• Rozšíření automatizace a validace workflowů pro regulovanou QC (stability studies, release testing) a implementace standardizovaných kalibrací (referenční materiály jako NIST mAb) pro mezinárodní srovnatelnost dat.
• Pokrok v softwarových nástrojích pro dekonvoluci pozičních izomerů a kvantitativní popis DAR distribucí (komplementární k systémům HIC/MS) bude klíčový pro zrychlení vývoje ADC.

Závěr

Agilent ProteoAnalyzer poskytuje robustní a reprodukovatelný CE-SDS přístup pro charakterizaci jak cysteinových, tak lysinových ADC. Metoda umožňuje spolehlivý sizing a kvantifikaci hlavních fragmentů, identifikaci výrobních crosslinků a sledování heterogenity vyplývající z konjugace. Pro úplnou charakterizaci DAR a pozice payloadu je doporučena kombinace s HIC a MS. Díky vysoké opakovatelnosti a možnosti paralelního zpracování je metoda vhodná pro rutinní QC i výzkumné aplikace v oblasti ADC.

Reference

1. Chen T., Chen Y., Stella C., Medley C. D., Gruenhagen J. A., Zhang K. Antibody-Drug Conjugate Characterization by Chromatographic and Electrophoretic Techniques. Journal of Chromatography B, 2016, 1032, 39–50.
2. Wakankar A. A., Feeney M. B., Rivera J., Chen Y., Kim M., Sharma V. K., Wang Y. Physicochemical Stability of the Antibody−Drug Conjugate Trastuzumab-DM1: Changes due to Modification and Conjugation Processes. Bioconjugate Chemistry, 2010, 21(9), 1588–1595.
3. Protein Sizing and Quantification with the Agilent ProteoAnalyzer System. Agilent Technologies technical overview, publication number 5994-6718EN, 2023.
4. Luttgeharm K., Pike W. Accurate mAb Sizing Using the NIST mAb as a Ladder for the Agilent ProteoAnalyzer System. Agilent Technologies application note, publication number 5994-8815EN, 2025.
5. Agilent Protein Broad Range P240 Kit. Agilent Technologies quick guide, publication number D0031125, 2025.
6. Analysis of NIST Antibody on the Agilent ProteoAnalyzer System. Agilent Technologies technical overview, publication number 5994-6960EN, 2024.
7. Ning W., Zhao Y. Characterization of ADCs by Capillary Electrophoresis. Methods in Molecular Biology, 2019, 251–262.
8. Wiggins B., Liu-Shin L., Yamaguchi H., Gayathri R. Characterization of Cysteine-Linked Conjugation Profiles of Immunoglobulin G1 and Immunoglobulin G2 Antibody–Drug Conjugates. Journal of Pharmaceutical Sciences, 2015, 104(4), 1362–1372.
9. Le L. N., Moore J. M. R., Ouyang J., Chen X., Nguyen M. D. H., Galush W. J. Profiling Antibody Drug Conjugate Positional Isomers: A System-of-Equations Approach. Analytical Chemistry, 2012, 84(17), 7479–7486.
10. Schneider S. Analysis of ADCs Using HIC with the Agilent 1290 Infinity II Bio LC System. Agilent Technologies application note, publication number 5994-2691EN, 2024.