Analysis of NIST Antibody on the Agilent ProteoAnalyzer System

Význam tématu

Monoklonální protilátky (mAb) patří mezi klíčové biotechnologické produkty s širokým využitím v terapii i diagnostice. Standardizované referenční materiály, jako je NISTmAb, umožňují ověřování přesnosti a přesnosti analytických metod používaných pro hodnocení čistoty, velikosti a modifikací těchto protilátek. Vysokorozlišovací kapilární elektroforéza za denaturačních podmínek (CE-SDS) je zlatým standardem pro stanovení velikostní heterogenity, avšak tradiční jednocapilární systémy nabízejí omezený průtok a vyžadují značnou obsluhu.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo srovnat výkon nové automatizované platformy Agilent ProteoAnalyzer s tradičním jednocapilárním CE-SDS použitým pro charakterizaci NISTmAb. Analýza se zaměřila na klíčové kvality atributy (CQAs): čistotu monomeru, obsah thioetru a obsazení glykanů za redukovaných i neredukovaných podmínek.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorek NISTmAb (lot 14HB-D-002) byl připraven v PBS při koncentraci 2 000 ng/µl za redukovaných i neredukovaných podmínek podle manuálu Agilent Protein Broad Range P240 kitu. Pro značení vzorků bylo inkubováno při 70 °C po dobu 10 min. Analýzy probíhaly na systému Agilent ProteoAnalyzer s použitím:

• ProteoAnalyzer Brand Range kitu (p/n 5191-6640)
• Dolního markeru (LM) pro neredukovaný režim, volitelný horní marker (UM) pro redukovaný režim
• Podmínek injekce: 7 kV po 6 s pro neredukované a 10 kV po 10 s pro redukované vzorky

Hlavní výsledky a diskuse

Porovnáním s NIST datasheetem byly naměřeny:

• Čistota monomeru (neredukováno): 98,18 % vs. 98,47 % (NIST)
• Thioether (redukováno): 0,40 % vs. 0,30 %
• Obsazení glykanů (redukováno): 99,30 % vs. 99,39 %

Rozlišení fragmentů NGHC a HC dosáhlo průměrné hodnoty R = 1,60 (specifikace ≥ 1) s 4,5 % CV (n = 33). ProteoAnalyzer spolehlivě zobrazoval hlavní špičku monomeru, L-řetězec, H-řetězec, dílčí fragmenty (Fab) a agregáty vysoké molekulové hmotnosti.

Přínosy a praktické využití metody

• Vyšší paralelní průtok až 12 vzorků současně bez nutnosti zásahu operátora
• Automatizované zpracování a vyhodnocování dat včetně digitálního gelu a elektrofereogramu
• Vysoká reprodukovatelnost a přesnost CQA měření

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozšíření automatizovaných elektroforetických platforem pro komplexní charakterizaci protilátek, včetně online integrace glykoanalýz, sledování chemických modifikací a napojení na LIMS systémy pro zlepšení kvality a sledovatelnosti dat.

Závěr

Agilent ProteoAnalyzer poskytuje výsledky srovnatelné s tradičním jednocapilárním CE-SDS, přičemž nabízí vyšší propustnost, automatizaci a uživatelskou přívětivost. Jeho použití přispívá k efektivnímu řízení kvality mAb v biofanarmaceutickém výzkumu a výrobě.

Reference

• National Institute of Standards and Technology; U.S. Department of Commerce. Reference Material 8671: NISTmAb, Humanized IgG1κ Monoclonal Antibody, Lot 14HB-D-002. Reference Material Information Sheet (2018).
• Turner A., Yandrofski K., Telikepalli S., King J., Heckert A., Filliben J., Ripple D., Schiel J. E. Development of orthogonal NISTmAb size heterogeneity control methods. Anal Bioanal Chem 410(8):2095–2110 (2018).
• Schiel J. E., Turner A., Mouchahoir T., Yandrofski K., Telikepalli S., King J., DeRose P., Ripple D., Phinney K. The NISTmAb Reference Material 8671 Value Assignment, Homogeneity, and Stability. Anal Bioanal Chem 410(8):2127–2139 (2018).
• Agilent Technologies. Dependable Denaturing Protein Electrophoresis; Agilent ProteoAnalyzer system, brochure 5994-6716EN (2023).
• Moritz B., Stracke J. O. Assessment of Disulfide and Hinge Modifications in Monoclonal Antibodies. Electrophoresis 38(6):769–785 (2017).