Simultaneous Analysis of 97 Primary Metabolites By PFPP: Pentafluorophenylpropyl Column

Význam tématu

Metabolická analýza primárních metabolitů je klíčová pro pochopení energetického metabolismu buněk. Kvantifikace aminokyselin, organických kyselin, nukleotidů a koenzymů umožňuje studium glykolýzy, TCA cyklu a dalších biochemických drah. Častou překážkou je vysoká hydrofilita těchto sloučenin, která omezuje jejich separaci v klasické převrácené fázi.

Cíle a přehled studie

Cílem prezentované studie je vyvinout a demonstrovat metodiku pro simultánní analýzu 97 primárních metabolitů z tkáňových extraktů pomocí PFPP kolonky. Studie ukazuje možnosti detekce a kvantifikace klíčových sloučenin z jater a srdečního svalu myší.

Použitá metodika a instrumentace

Pro separaci byl použit pentafluorophenylpropyl (PFPP) sloučený s hydrofobní interakcí, což umožňuje udržení i vysoce polárních molekul. Extrakce metabolitů proběhla metodou methanol-chloroform s následnou koncentrací vodné fáze.

• Kolonka: Discovery HS F5-3 (2.1×150 mm, 3 μm)
• Mobilní fáze A: 0,1 % kyselina mravenčí/voda
• Mobilní fáze B: 0,1 % kyselina mravenčí/acetonitril, gradient 0–95 % B v 20 min
• Detektor: Shimadzu LCMS-8040 Triple Quadrupole UFMS
• Ionizace: ESI pozitivní/negativní režim, rychlé přepínání polarity

Hlavní výsledky a diskuse

Při analýze extraktů z jater a srdce bylo detekováno přes 80 metabolitů s dobře rozlišenými vrcholy. U obou tkání byly identifikovány klíčové sloučeniny jako ATP prekurzory (AMP), glutathion ve formě GSH/GSSG či aminokyseliny leucinu a isoleucinu. Rozdíly v relativních oblastech TCA cyklu, zejména pyruvát, citrát, sukcinát a malát, odrážejí odlišnou energetickou aktivitu mezi tkáněmi.

Přínosy a praktické využití metody

Měření primárních metabolitů pomocí PFPP kolonky a LC-MS/MS přináší:

• Univerzální separaci hydrofilních i hydrofóbních sloučenin
• Krátký analytický běh (<25 min) s vysokou citlivostí
• Možnost simultánní kvantifikace širokého spektra metabolitů

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozšíření metody by mohlo zahrnovat multiplexní metabolomické studie klinických vzorků, dynamické sledování metabolických drah in vivo a integraci s lipidomikou či proteomikou. Vylepšení rychlosti a automatizace přípravy vzorků zvýší throughput a vhodnost pro rutinní rozbory v biomedicíně a farmaceutickém průmyslu.

Závěr

Použití PFPP kolonky ve spojení s rychlým LC-MS/MS systémem umožňuje efektivní a reprodukovatelné stanovení 97 primárních metabolitů v biologických vzorcích. Metoda poskytuje robustní nástroj pro výzkum energetického metabolismu a klinické aplikace.

Reference

Bez uvedené literatury v původním textu.