Enhancing sample throughput and proteome coverage with a novel tandem-LC MS/MS approach

Význam tématu

Vysoce citlivá nano-LC–MS/MS analýza je klíčová pro moderní bottom-up proteomiku, zejména v aplikacích vyžadujících nízké množství vzorku a vysokou hloubku pokrytí proteomu. Provozní omezení přímé injekce (DI) při nano‑proudech (<1 µL/min) však často vedou k nízkému využití hmotnostního spektrometru a dlouhým režijním časům, což omezuje propustnost a ekonomiku velkoobjemových screeningů. Studie popisuje tandem direct injection (TDI) workflow na systému Thermo Scientific Vanquish Neo s cílem zvýšit efektivní čas gradientu, zlepšit separační výkon a navýšit počet identifikovaných a kvantifikovaných proteinů při zachování kvantitativní přesnosti.

Cíle a přehled studie / článku

Hlavní cíle byly:

• Ověřit, zda tandemní LC konfigurace (dva paralelně provozované analytické kanály se synchronizovaným přepínáním spraye) zvýší efektivní gradientový čas bez navýšení celkové doby cyklu.
• Porovnat výkonnost TDI s klasickou jednozónovou DI v oblasti počtu identifikovaných proteinů, kvantifikační přesnosti (CV), carryover a celkové propustnosti (samples per day, SPD).
• Demonstrace využití pro screeningové aplikace, konkrétně cílenou degradaci proteinů (TPD) na příkladu degraderu MZ1 a možností dalšího zvýšení propustnosti pomocí multiplexace (SILAC).

Použitá metodika a instrumentace

Konfigurace a klíčové postupy:

• Vanquish Neo tandemní UHPLC systém s přepínacími ventily umožňujícími paralelní přípravu jedné kolony během akvizice na druhé.
• Sonation double barrel oven (DBO) instalovaný na NanoSpray Flex ion source; řízení teploty a přepínání vysokého napětí synchronizováno softwarově.
• Orbitrap Astral MS v režimu data‑independent acquisition (DIA) pro vysokorychlostní a vysokoefektivní sběr dat.
• Analytické kolony: vlastní ručně plněné pulled‑tip kapiláry 75 µm ID × 20 cm (1,5 µm C18), provozované při 60 °C.
• Vzorky: tří‑organismový mix (Homo sapiens, Saccharomyces cerevisiae, E. coli) ve třech poměrech; dále buněčné lysáty pro TPD testy (MZ1 vs DMSO). Injekční objemy typicky 2 µL (800 ng) nebo 4 µL u některých režimů.
• Solventní systém: klasické A = H₂O + 0,1 % FA, B = 80/20 ACN/H₂O + 0,1 % FA; dolní pumpa použita pro re‑kondicionaci a mytí.
• Datové zpracování: Spectronaut (directDIA+), MaxLFQ pro label‑free kvantifikaci; FDR nastaveno <1 % na úrovni prekurzoru a proteinu.

Hlavní výsledky a diskuse

Klíčové nálezy:

• TDI zvyšuje efektivní dobu gradientu dostupnou pro separaci, protože zatímco jedna kolona probíhá eluce a sběr dat, druhá je intenzivně praná, ekvilibrovaná a naložena se vzorkem. To vede k vyšší prostorové kapacitě (peak capacity) a lepšímu rozlišení při stejném celkovém cyklu.
• Při testech se tříorganismovým HYE mixem dosahoval TDI konzistentně vyššího počtu identifikovaných proteinů v porovnání s DI, především při vyšších propustnostech. Například bylo identifikováno přibližně 11 000 proteinových skupin v 30 SPD a blízko 10 000 i při 96 SPD v TDI workflow.
• Kvantifikace: v režimu 96 SPD bylo možné kvantifikovat přibližně 7 500 proteinových skupin s CV < 10 %. Počet proteinů s CV < 10 % byl při 96 SPD u TDI téměř dvojnásobný oproti DI.
• Carryover: díky rozsáhlému mytí kolony v TDI bylo pozorováno výrazné snížení carryover – přibližně na polovinu při 48 SPD a až čtyřnásobné zlepšení při 96 SPD ve srovnání s DI.
• Robustnost mezi kolonkami: kvantitativní variabilita vyplývající z použití dvou odlišných kolonek byla menší než biologická variabilita mezi vzorky. PCA analýzy ukázaly jasné oddělení stavů vzorků (např. MZ1 vs DMSO), kde vliv používané kolony byl sekundární a nekompromitoval interpretaci.
• Praktická aplikace – cílená degradace: ve studii s MZ1 byl detekován očekávaný down‑regulovaný signál BRD4 (a další BRD rodiny) napříč všemi propustnostmi, což potvrzuje vhodnost TDI pro screeningy TPD.
• Multiplexace (SILAC): kombinace TDI s dvojitou nebo trojitou SILAC multiplexací výrazně zvyšuje efektivní počet analyzovaných vzorků (IPD – injections per day). Například dvojitá SILAC při 60 IPD odpovídá 120 SPD, trojitá SILAC 60 IPD dává až ~180 SPD, přičemž počet identifikací a kvantifikovaných proteinů zůstával ve srovnatelných rozsazích.

Přínosy a praktické využití metody

Praktické výhody TDI v proteomice:

• Výrazné zvýšení využití MS instrumentu bez kompromisu v separační kvalitě; lepší ekonomika analýzy u velkých kohort.
• Umožňuje uchovat vysokou hloubku proteomu i při velmi vysokých propustnostech, což je kritické pro screeningové kampaně (tisíce vzorků) a průmyslové proteomické služby.
• Snižuje carryover a tím snižuje potřebu častého čištění přístroje; prodlužuje životnost kolony a zvyšuje provozní robustnost.
• Flexibilita návrhu experimentu: multiplexace vzorků (SILAC, dimethyl) umožňuje další zvýšení efektivní propustnosti bez výrazného zhoršení kvality dat.

Budoucí trendy a možnosti využití

Možnosti rozvoje a doporučené směry:

• Další zvyšování propustnosti zkracováním gradientů je technicky možné, ale omezuje počet datových bodů na peak a tím kvantitativní přesnost; multiplexace nabízí praktičtější cestu k nárůstu throughputu bez ztráty kvality.
• Integrace TDI s automatizovanou přípravou vzorků a robustnějšími kolony (nové stacionární fáze, užší ID) může dále zvýšit citlivost a stabilitu v dlouhodobých projektech.
• Softwarová podpora: pokročilé algoritmy pro kalibraci mezi kolonkami a zpracování DIA dat (přesnější normalizace a kontrola mezi kanály) se stanou klíčovými pro standardizaci průmyslových pipeline.
• Rozšíření aplikací: od farmaceutického screeningu (TPD, small‑molecule screens) přes klinickou proteomiku až po metaproteomiku s vysokou propustností.

Závěr

Tandem direct injection workflow na platformě Vanquish Neo ve spojení s double‑barrel ion source a Orbitrap Astral MS představuje praktický způsob, jak vyrovnat požadavky na vysokou propustnost a hloubku proteomické analýzy. TDI zvyšuje efektivní čas gradientu, zlepšuje separační výkon, významně snižuje carryover a zachovává kvantitativní přesnost napříč dvěma kolonkami. Kombinace s multiplexováním (SILAC) umožňuje dosažení velmi vysokého počtu zpracovaných vzorků denně bez zásadního kompromisu datové kvality, což je zvláště atraktivní pro rozsáhlé screeningové studie a průmyslové proteomické služby.

Reference

1. Nagaraj N., Boychenko A., Valenta A. Thermo Fisher Scientific Webinar: A tandem LC workflow for maximizing mass spectrometer utilization in proteomics. 19 September 2024.
2. Zheng R., Rendl M., Valenta A., et al. Maximizing sample throughput and sensitivities in nano and capillary LC-MS: harnessing the advantage of a tandem direct injection workflow and a double barrel ion source. Thermo Fisher Scientific Technical Note 003335, 2024.
3. Sonation GmbH. Double barrel oven for Thermo Scientific NanoSpray Flex ion source ES071 and ES072. Product documentation, 2024.