Enhancing Immunopeptide Profiling with Orbitrap Astral Mass Spectrometer for Unbiased Discovery of Neoantigens

Význam tématu

Studium imunopeptidomu umožňuje identifikovat peptidy prezentované molekulami MHC na buněčném povrchu, což je klíčové pro vývoj personalizovaných imunoterapií a objev nových neoantigenů. Vysoká citlivost a selektivita v detekci drobných nádorově specifických antigenů přináší zásadní přínos ve výzkumu imunoonkologie a vývoji cílených terapeutik.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem studie bylo demonstrovat schopnosti kombinace vysokovýkonné chromatografie UHPLC Vanquish Neo s novým Orbitrap Astral hmotnostním spektrometrem pro analýzu MHC třídy I peptidů z buněk HCT-116. Metoda se opírá o label-free DDA strategii a umožňuje studium vzorků s velmi nízkým vstupním materiálem.

Použitá metodika a instrumentace

Peptidy třídy I byly izolovány imunoafinity pomocí pan-specifické protilátky W6/32 z 100 milionů buněk HCT-116. Po saturaci a očistě na StageTips byl výtěžek naředěn 100× s 0,1 % kyselinou mravenčí, odpovídal ekvivalentu E+4 až E+7 buněk. Separation proběhla na systému Vanquish Neo UHPLC v režimu trap-and-elute s kolonkou PepMap Neo Trap a Aurora Ultimate (25 cm × 75 µm), doba analýzy 72 minut. Ionizace zajištěna EASY-Spray Ion Source s FAIMS Pro Duo. Spektrometrie probíhala na Orbitrap Astral MS s rozlišením 120 000, m/z rozsah 300–1500 pro MS1, DDA režim HCD s kolizní energií 29 a cyklem 0,6 s.

Hlavní výsledky a diskuse

• Optimalizace FAIMS: dvojí CV (-50 a -70 V) zlepšila pokrytí peptidomu, přičemž každé napětí přineslo unikátní subset peptidů.
• Senzitivita: detekce peptidů byla možná od ekvivalentu E+5 buněk, s lineárním nárůstem počtu identifikovaných peptidů až do E+7 buněk.
• Délka a náboj peptidů odpovídaly očekávanému profilu HLA-I (dominance +2 nábojových stavů a délka 8–11 aminokyselin).
• Izolační šířka ovlivnila poměr PSM/MS2, úzká šířka zvyšovala selektivitu při vyšších vstupních náložích.

Přínosy a praktické využití metody

• Vyšší citlivost a dynamický rozsah Orbitrap Astral MS umožňuje detekci vzácných neoantigenů z minimálních vzorků.
• Reprodukční analýza s vysokou propustností podporuje širší imunopeptidomické studie v preklinickém výzkumu.
• Metoda je kompatibilní se vzorky z biopsií či tkání, kde je počet buněk omezený.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace s metodami hluboké de novo sekvenace (DeepNovo) pro identifikaci neznámých peptidů.
• Další optimalizace FAIMS a režimů DDA/DIA pro maximalizaci pokrytí peptidomu.
• Rozšíření aplikace na imunopeptidomiku dalších MHC tříd a spekulární buňky pro personalizovanou medicínu.

Závěr

Kombinace Vanquish Neo UHPLC a Orbitrap Astral MS poskytuje výrazné zlepšení citlivosti, selektivity a hloubky pokrytí imunopeptidomu. Metoda umožňuje studium MHC-I peptidů i při velmi nízkém množství výchozího materiálu, což otevírá nové možnosti v objevování neoantigenů a vývoji personalizovaných imunoterapií.