Using mass spectrometry-based proteomics to power spatial biology for deep proteomic profiling

Význam tématu

Studium prostorové proteomiky na bázi hmotnostní spektrometrie otevírá nové možnosti v pochopení buněčné heterogenity při zachování prostorového kontextu tkání. To je klíčové v oborech jako onkologie, neurobiologie nebo vývojová biologie, kde mikroprostředí a sousedské interakce určují funkci, plastickost a patologický průběh. Integrace vysoce multiplexních zobrazovacích metod s ultra citlivou LC–MS/MS umožňuje objevovat nové buněčné stavy, biomarkery a terapeutické cíle, které zůstanou skryté při použití pouze cílených metod založených na protilátkách.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem publikovaného projektu bylo vyvinout a ověřit workflow nazvané multiplexed Deep Visual Proteomics (mxDVP), které kombinuje vysoce multiplexní imuno-fluorescenční zobrazování, interaktivní segmentaci a anotaci buněk, přesný přenos kontur pomocí laserové mikrodisekce a následnou ultra-citlivou proteomickou analýzu. Studie si kladla za cíl: identifikovat a kvantifikovat proteomy buněčných subpopulací v prostorovém kontextu, odhalit vzácné a přechodné buněčné stavy v lidských pankreatických ostrůvcích a demonstrovat reprodukovatelnost a hloubku pokrytí proteomu z velmi nízkých vstupních množství.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika mxDVP zahrnuje sedm kroků: návrh panelu protilátek, získání vysokopleXních obrazů, segmentaci a datovou analýzu, použití polychromatického barvení pro přesný přenos kontur, laserovou mikrodisekci vybraných klastrů, LC–MS/MS analýzu a integrovanou bioinformatickou analýzu. Klíčové prvky workflow:

• Vysoce multiplexní imunofluorescenční zobrazování pro mapování typů a stavů buněk in situ.
• Interaktivní obrazová analýza a anotace pomocí vlastního pipeline PIPΣX (integrace s TissUUmaps) a BIAS pro přesnou modifikaci kontur.
• Přesné laserové mikrodisekce (LMD) kontur exportovaných z obrazových dat; optimalizace na PPS membrány a Toluidine Blue pro zajištění integrity vzorku a přesného vyříznutí.
• Pooling strategie kontur — empiricky optimalizované spojení ~250 2D kontur (~100 ekvivalentů buněk) pro dosažení rovnováhy mezi hloubkou proteomu a obohacením vzácných populací.
• Ultra-citlivá LC–MS/MS analýza s použitím Thermo Scientific Orbitrap Astral MS pro maximalizaci přenosu iontů, rozlišení a rychlosti akvizice.
• Kvalitativní a kvantitativní kontroly: technické repliky, CV <10 %, procentuální překryv identifikací >85 %, Pearsonovy korelace replik >0,95.

Konkrétní instrumentace:

• Orbitrap Astral Mass Spectrometer (Thermo Scientific) pro ultra-citlivé proteomické měření.
• VysokopleXní imuno-fluorescenční platformy (CODEX / víceciklické imuno-stainovací protokoly) pro získání komplexních obrazů.
• Systémy pro laserovou mikrodisekci kompatibilní s exportem kontur (LMD mikroskopy) a PPS/ PEN membrány pro tkáňové řezy.

Hlavní výsledky a diskuse

Studie demonstrovala, že mxDVP umožňuje hluboké proteomické pokrytí z velmi nízkých vstupů: bylo dosaženo >6 000 identifikovaných proteinových skupin z přibližně 100 ekvivalentů buněk (pool ~250 kontur) a zhruba 3 600 buněčných subpopulací analyzovaných napříč experimenty. Klíčové poznatky:

• Objeveno výrazné heterogenity v lidských pankreatických ostrůvcích, včetně vzácných polyhormonálních hybridních buněk, které ko-exprimují markery typické pro alfa-, beta- a delta-buňky a vykazují unikátní proteomické signatury ukazující na metabolickou adaptaci a stresové odpovědi.
• Gradienty stresových a plasticitních markerů naznačují přechodné stavy buněk v islet niku, což zpochybňuje tradiční pevné zařazení endokrinních buněk.
• Pečlivé optimalizace (membrány PPS, Toluidine Blue, promývací kroky po barvení) eliminovaly interferenci reziduálních protilátek nebo pufrů v hmotnostní spektrometrii — kontrolní experimenty neukázaly znatelnou kontaminaci proteomických profilů.
• Reprodukovatelnost byla vysoká: technické repliky vykazovaly CV pod 10 % a vysoké Pearsonovy korelace mezi replikami; identifikace proteinů měly >85% překrytí mezi replikami.

Diskuse zdůrazňuje, že kombinace obrazové fenotypizace a nezávislého, neřízeného proteomického čtení umožňuje objevit nové, neočekávané buněčné stavy, které by výhradně cílené zobrazování nepokrylo.

Přínosy a praktické využití metody

Hlavní přínosy mxDVP:

• Možnost objevovat vzácné a přechodné buněčné fenotypy v kontextu tkáňové architektury.
• Kombinace prostorové přesnosti imunoobrazování s hloubkou LC–MS/MS pro komplexní molekulární charakterizaci.
• Vysoká citlivost umožňující proteomické profily z nízkého počtu buněk, což je důležité pro studie vzácných populací nebo limitovaných klinických vzorků.
• Modularita workflow umožňuje přizpůsobení: volba mezi hlubokým profilováním proteomu nebo rozsáhlým mapováním prostorových vztahů.

Praktické aplikace zahrnují biomarker discovery, mapování patofyziologických procesů (např. diabetických změn v ostrůvcích), identifikaci terapeutických cílů a podrobnou analýzu mikroprostředí nádoru či neurobiologických struktur.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry vývoje a rozšíření aplikací mxDVP:

• Zvyšování průchodnosti a škálovatelnosti díky rychlejším masovým spektrometrům, automatizaci LMD a zlepšeným ultra-citlivým akvizičním režimům.
• Integrace s dalšími „omics“ (transkriptomika, metabolomika) pro vícevrstevné prostorové mapování tkáně.
• Využití v klinických kohortách a biobankách pro validaci biomarkerů a retrospektivní analýzy FFPE vzorků.
• Pokročilá bioinformatika a strojové učení pro lepší interpretaci heterogenity a detekci vzácných fenotypů z multi-modalních dat.

Závěr

mxDVP představuje robustní, reprodukovatelné a vysoce citlivé řešení pro prostorovou proteomiku, které spojuje výhody vysoce multiplexního zobrazování a hluboké, nezávislé proteomické analýzy. Workflow umožnilo odhalit nové biologické poznatky v lidských pankreatických ostrůvcích, včetně vzácných polyhormonálních buněk a přechodných stavů, při současném zajištění vysoké kvality dat a minimální interference ze zobrazovacích reagensů. Díky modularitě a pokračujícímu vývoji instrumentace má metoda silný potenciál pro translací výzkumu do širších klinických aplikací.

Reference

1. PIPΣX Image Analysis with PIPΣX: An Integrated Automated Pipeline for Image Processing and EXploration for Diverse Tissue Types. bioRxiv 2025.05.04.652145.
2. Mardamshina M., Lundberg E. et al. Streamlining Multiplexed Tissue Spatial Proteomics with mxDVP. (Studie a případová data prezentované v Case Study 004216, Thermo Fisher Scientific, 2025).