Enhancing protein quantification and sample throughput with TMTpro 32plex label reagents and extended supporting features from the Orbitrap Ascend MultiOmics mass spectrometer

Význam tématu

Quantitativní multiplexní proteomika je klíčová pro srovnávání proteomických profilů napříč mnoha vzorky v klinických i výzkumných studiích. Zvýšení multiplexní kapacity a zachování kvantitativní přesnosti umožňuje snížit technické variabilní a počet LC–MS běhů, minimalizuje chybějící hodnoty a zvyšuje statistickou sílu detekce drobných biologicky významných změn.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem technické poznámky bylo ověřit výkon kombinace TMTpro 32plex izobarických značek a spektrometru Orbitrap Ascend MultiOmics Tribrid pro vysoce multiplexní kvantitativní proteomiku. Studie porovnává rozlišení potřebné k rozlišení velmi blízkých reporter ionů (∆m ≈ 3 mDa), testuje nové zpracování (PhiSDM/TurboTMT), hodnotí vliv různých nastavení rozlišení na identifikace a kvantifikaci a ukazuje přínos RTS (real-time search) se synchronous precursor selection (SPS) MS3 pro snížení interferencí.

Použitá metodika a instrumentace

Využitá instrumentace a hlavní metodické kroky:

• Hmotnostní spektrometr: Thermo Scientific Orbitrap Ascend MultiOmics Tribrid MS.
• Multiplexní značky: Thermo Scientific TMTpro 32plex (včetně deuterovaných izotopologů tvořících sub-plexy s ∆m ≈ 2.9–3 mDa).
• UHPLC: Thermo Scientific Vanquish Neo UHPLC ve direct-injection konfiguraci, EASY-Spray zdroj a EASY-Spray PepMap Neo UHPLC kolona 75 μm × 500 mm, 2 μm, ohřev kolonky na 40 °C.
• Spotřební materiál a příprava: EasyPep MS Sample Prep kit, Pierce 6 protein digest pro spike-in, standardní LC-MS grade rozpouštědla.
• Akvizice: DDA s real-time search (RTS) + SPS-MS3 a alternativně MS2; nastavení zahrnuje použití TurboTMT (PhiSDM) pro zvýšení efektivního rozlišení v oblasti reporter iontů. Testovaná nastavení rozlišení: 30k, 45k TurboTMT, 60k TurboTMT, 75k eFT, 90k eFT, 120k eFT.
• Zpracování dat: Thermo Proteome Discoverer 3.3; Reporter Ions Quantifier (integrační toler. 11 ppm, Most Confident Centroid), Reporter Ions Control Channel Normalizer pro škálování deuterovaného a nedeuterovaného sub-plexu; statická modifikace TMTpro (+304.207 Da) na N-terminu a Lys, variabilní oxidace Met.
• Experimentální designy: HeLa digest označený 32plex (poměry 1:4 a 1:10 mezi deuterovanými a nedeuterovanými kanály) a HeLa digest se 6-proteinovým mixem spike-in (koncentrace 100, 200, 400, 800 fmol/µg) pro měření interference a kvantitativní přesnosti.

Hlavní výsledky a diskuse

• Rozlišení potřebné pro rozlišení ∆m ≈ 3 mDa: klasické eFT zpracování vyžaduje ~75k pro částečné rozlišení (5 % baseline) a ≥90k pro úplné baseline rozlišení. Použití PhiSDM (TurboTMT) umožňuje spolehlivé oddělení reporterů při 45k, čímž zvyšuje propustnost bez kritické ztráty kvantitativní přesnosti.
• Účinnost identifikací a kvantifikací: Při RTS se SPS-MS3 a 45k TurboTMT nastavením pro MS3 dosahuje 32plex podobného počtu kvantifikovaných proteinů jako 16plex při 45k, s rozdílem <5 %. Zvýšení rozlišení na 75k/90k vede ke snížení počtu kvantifikovaných proteinů (~10–28 %) kvůli delším FT transjentům a snížení rychlosti měření.
• Kvantitativní přesnost: RTS se SPS-MS3 významně snižuje vliv ko-izolace (co-isolation) a zkreslení poměrů oproti MS2-only metodám, zejména u spike-in experimentů s vysokým pozadím (HeLa). MS2 metody vykazovaly větší rozptyl a horší přesnost v přítomnosti interference.
• Zvýšení propustnosti: Jedno 32plex spuštění (RTS+SPS-MS3, vhodné nastavení) kvantifikovalo o 7–12 % více proteinů a o 13–22 % více peptidů než dvě 16plex akvizice díky eliminaci chybějících hodnot mezi běhy.
• Normalizace sub-plexů: Deuterované kanály vykazují drobný posun retenčního času (~0.5–1 s) oproti nedeuterovaným; použití kontrolních kanálů a Reporter Ions Control Channel Normalizer v Proteome Discovereru efektivně škáluje a koriguje tento efekt pro přesné komparace.

Přínosy a praktické využití metody

• Výrazné zvýšení multiplexní kapacity (32 kanály) zdvojnásobuje počet vzorků analyzovaných v jednom běhu, což snižuje náklady na analýzu na vzorek a minimalizuje mezi-běhové artefakty.
• RTS + SPS-MS3 kombinace poskytuje robustní kvantifikaci v komplexních matricích (klinické nebo populační studie) díky redukci interference a přesnějšímu měření relativních abundancí.
• Použití TurboTMT (PhiSDM) umožní kompromis mezi rychlostí akvizice a rozlišením potřebným pro TMTpro 32plex bez nutnosti extrémně dlouhých transjentů.
• Proteome Discoverer 3.3 umožňuje integraci normalizace sub-plexů a calibraci reporter abundancí, což je nutné pro správné srovnání deuterovaných a nedeuterovaných kanálů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Dalsí rozvoj spektrálního zpracování (např. zdokonalené algoritmy pro dekonvoluci a rychlejší FT zpracování) umožní ještě vyšší multiplexování při zachování rychlosti a přesnosti.
• Integrace RTS a inteligentních strategií předzpracování bude pokračovat v redukci interference a zlepšení detekce nízko-abundantních proteinů v populacích pacientů.
• Rozšíření 32–35 plex přístupů do klinických režimů a large-cohort studií sníží náklady a zvýší statistickou sílu objevů biomarkerů.
• Další standardizace normalizačních postupů a zpracovacích workflow (v SW jako Proteome Discoverer) zlepší reprodukovatelnost mezi laboratořemi.

Závěr

Studie ukazuje, že kombinace TMTpro 32plex značek a Orbitrap Ascend MultiOmics MS je prakticky použitelná pro vysoce multiplexní kvantitativní proteomiku. Klíčovým prvkem je vyvážení rozlišení a akviziční rychlosti: použití TurboTMT (PhiSDM) při 45k poskytuje nejlepší kompromis mezi počtem identifikací a kvantitativní přesností, zatímco RTS s SPS-MS3 významně zlepšuje přesnost kvantifikace v přítomnosti ko-izolace. Proteome Discoverer 3.3 poskytuje nástroje pro normalizaci deuterovaných sub-plexů, čímž zajišťuje validní porovnání kanálů.

Reference

• Pappireddi N, Martin L, Wühr M. A Review on Quantitative Multiplexed Proteomics. Chembiochem. 2019 May 15;20(10):1210-1224. doi:10.1002/cbic.201800650.
• Zuniga NR, Frost DC, Kuhn K, Shin M, Whitehouse RL, Wei TY, He Y, Dawson SL, Pike I, Bomgarden RD, Gygi SP, Paulo JA. Achieving a 35-Plex Tandem Mass Tag Reagent Set through Deuterium Incorporation. J Proteome Res. 2024 Nov 1;23(11):5153-5165. doi:10.1021/acs.jproteome.4c00668.