Enhancing the resolving power on an Orbitrap Astral Zoom mass spectrometer for TMTPro 35plex applications

Význam tématu

Multiplexní kvantitativní proteomika s použitím izobarických TMT štítků umožňuje současné porovnání desítek vzorků s vysokou přesností a minimem chybějících dat
Orbitrap Astral Zoom mass spektrometr v režimu TMT HR dovoluje dosáhnout rozlišení potřebného k odlišení 3 mDa rozdílů u TMTpro 35plex aplikací a současně vysokou propustnost přes 400 běhů za den

Cíle a přehled studie

Cílem bylo vyvinout a ověřit nový akviziční režim s oddělenými MS2 skeny pro identifikaci (ID) a vysoce rezolutní kvantifikaci (QUAN)
Metoda byla benchmarkována na standardech triple knock-out (TKO) k optimalizaci parametrů a poté aplikována na TMTpro 32plex vzorky lidských buněk (HeLa) s očekávaným poměrem 1:4

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky HeLa byly označeny TMTpro 18plex a TMTpro-D 14plex reagenciemi a připraveny pomocí EasyPep kitů
Separace probíhala na kolonce Ionopticks Aurora Frontier XT (75 μm×60 cm) s Vanquish Neo UHPLC a gradientem 80 min
Akvizice využívala Orbitrap Astral Zoom s multi-pass režimem k prodloužení dráhy iontů a zvýšení rozlišení nad 90 000 FWHM při m/z 130
Pro identifikaci byly MS2 skeny prováděny při standardním Astral rozlišení, pro kvantifikaci pak TMT HR QUAN skeny s optimalizovaným NCE, šířkou okna a AGC
Data byla vyhodnocena v Proteome Discoverer 3.3 s uzlem pro TMT HR QUAN MS2 a filtrováním kompletních kvantifikačních spekter

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizace kolizní energie ukázala ideální NCE 32 % pro ID a 55 % pro QUAN, přičemž S/N reporter iontů dosahuje přibližně 50 % oproti MS2 režimu
Nastavení izolace 0,7 Th a AGC 200–250 % poskytuje nejlepší kompromis mezi intenzitou signálu a minimalizací rušivých signálů
Zvýšení náložky z 500 ng na 1,5 μg zvýšilo počet kvantifikovaných peptidů o 20 % a zachovalo vysokou přesnost
V aplikaci na TMTpro 32plex HeLa bylo identifikováno 4 299 proteinových skupin a 22 146 peptidů, z toho 94 % proteinových skupin a 78 % peptidů plně kvantifikováno
Spektrum reporter iontů hmotnosti 131 ukázalo rozlišení nad 100 000 pro všechny čtyři kanály v poměru 1:4

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje vysokopropustné a vysoce přesné multiplexní kvantifikace proteomu v režimu až 440 vzorků za den
Vysoké rozlišení Astral analyzátoru zajišťuje diskriminaci blízkých izotopních hmotností a minimalizuje rušení signálu
Oddělená optimalizace parametrů pro identifikaci a kvantifikaci zvyšuje flexibilitu nasazení v průmyslové analytice i výzkumných laboratořích

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozšíření na TMTpro 35plex s dalšími izotopologickými kanály a kombinace s DIA režimy pro ještě hlubší krytí proteomu
Automatizace nastavení parametrů akvizice pomocí strojového učení a pokročilých algoritmů pro optimalizaci S/N v reálném čase
Integrace s pokročilou bioinformatikou a cloudovými platformami pro špičkovou proteomickou analýzu v klinickém výzkumu

Závěr

Představený akviziční režim na Orbitrap Astral Zoom přináší vyváženou optimalizaci identifikace a kvantifikace u TMTpro pokročilých plexů
Metoda prokázala vysokou rozlišovací schopnost, reprodukovatelnost a propustnost, což ji činí vhodnou pro rozsáhlé proteomické studie

Reference

• Zuniga M., Achieving a 35-Plex Tandem Mass Tag Reagent Set through Deuterium Incorporation; Journal of Proteome Research 2024; 23(11):5153–5165; DOI:10.1021/acs.jproteome.4c00668