Expanding TMTpro reagents to 32-plex for high-throughput quantitative proteomics on Orbitrap platforms

Význam tématu

Multiplexní kvantitativní proteomika je klíčovou metodou pro komplexní porovnání biologických vzorků, a vyšší plexnost zvyšuje propustnost i kvalitu získaných dat.

Cíle a přehled studie

Vývoj a charakterizace nových deuterovaných TMTpro reagencií s ∆m: 3 mDa pro rozšíření multiplexu na 32 kanálů na platformách Orbitrap.
Studie analyzuje účinnost značení, rozlišení reporter iontů a kvantitativní výkon ve srovnání s existujícími 16- a 18-plex sadami.

Použitá metodika a instrumentace

• Vzorky: HeLa S3 digesti připravené pomocí EasyPep protokolu, značení TMTpro reagenty.
• Chromatografie: nanoflow UHPLC Vanquish Neo s 50 cm C18 EASY-Spray kolonkou, gradient 2–32 % ACN během 120 min při 300 nl/min.
• Spektrometrie: Orbitrap Eclipse Tribrid, MS1 při 120 000 RP, MS2 HCD FT-MS2 při RP ≥ 75 000 nebo TurboTMT 45 000, DDA režim s 3 s cyklem a dynamickým vyloučením 60 s.
• Data processing: Proteome Discoverer 3.0 s algoritmem SEQUEST HT, FDR 1 %, integrace reporter iontů v 11 ppm okně.

Hlavní výsledky a diskuse

• Deuterované TMTpro reagenty vykázaly 98 % inkorporaci 2H a značení s > 99,5 % účinností.
• Reporter ionty s ∆m: 3 mDa jsou rozlišitelné při RP ≥ 75 000 nebo TurboTMT 45 000 v MS/MS spektru.
• Kvantitativní výkon 32-plex s průměrným CV ~7,7 % je srovnatelný s 16-plex (CV ~6,4 %) a 18-plex sadami.
• RT posun deuterovaných kanálů byl minimální a kompenzovaný v rámci sady referenčními kanály.
• 32-plex experiment přinesl o 15 % více kvantifikovaných proteinů a o 39 % více peptidů než dvě 18-plex měření.

Přínosy a praktické využití metody

• Zvýšení propustnosti a konzistence dat díky jednomu běhu až 32 vzorků.
• Snížení variability a chyb způsobených více LC-MS běhy.
• Ekonomicky efektivní přístup pro rozsáhlé biologické a klinické studie.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další rozšiřování plexnosti reagencií pro vysokodimenzionální studie proteomu.
• Integrace s RTS SPS-MS3 a AI-řízenou analýzou dat pro zlepšení specifičnosti a citlivosti.
• Použití v klinické proteomice, farmacii a systémové biologii pro dynamickou analýzu proteinových změn.

Závěr

Nové deuterované TMTpro reagenty umožňují multiplexní kvantifikaci až 32 vzorků při srovnatelné přesnosti a preciznosti s existujícími 16- a 18-plex sadami. Metoda přináší významné zvýšení efektivity a kvality dat pro rozsáhlé proteomické studie.

Reference

• Frost D., Paulo J. A., Gygi S. P., Kuhn K., Pike I., Bomgarden R. Expanding TMTpro reagents to 32-plex for high-throughput quantitative proteomics on Orbitrap platforms. Thermo Fisher Scientific, P-I-0120, 2024.