Virus molecular weight and empty/full capsid ratio measurements on a Q Exactive UHMR mass spectrometer using Direct Mass Technology mode

Význam tématu

Adeno-asociované viry (AAV) jsou klíčovými vektory genové terapie; kvalita přípravků závisí na přesném určení podílu prázdných a naplněných kapsid. Tradiční metody, zejména analytická ultracentrifugace (AUC), vyžadují značné množství vzorku a času. Orbitrap‑based Charge Detection Mass Spectrometry (CDMS), provozovaná v režimu Direct Mass Technology na Q Exactive UHMR, umožňuje rychlé stanovení molární hmotnosti a poměru prázdných/naplněných kapsid při výrazně nižší spotřebě vzorku, což má přímý dopad na vývoj, kontrolu kvality a uvolňování AAV produktů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem aplikace bylo ukázat, že Q Exactive UHMR v režimu Direct Mass Technology dokáže přesně a reprodukovatelně měřit molární hmotnost AAV a určovat poměr prázdných/naplněných kapsid. Studie rovněž poskytuje doporučení nastavení přístroje a parametrů zpracování dat (STORIboard) tak, aby byla minimalizována systematická zkreslení a maximalizována reprodukovatelnost výsledků pro různé serotypy AAV a různé poměry prázdných a naplněných částic.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky: komerčně dostupné prázdné a naplněné kapsidy AAV2, AAV8 a AAV9 (koncentrace uvedeny ~2E+13 vp/vg mL), které byly smíchány v objemových poměrech 25/75, 50/50 a 75/25 (prázdné/naplněné). Vzorky byly převedeny do 200 mM roztoku octanu amonného pomocí filtrů s mezí molekulové hmotnosti 100 kDa.

Ionizace a zdroj: elektrosprej s NanoSpray Flex ion source, borosilikátové emitery (P/N ES387/388), typické napětí spreje ~1,2 kV. Nádech plynů pro zachytávání iontů byl proveden primárně dusíkem; těžší plyny (Xe, SF6) jsou doporučeny, pokud je laboratoř vybavena.

Přístroj: Thermo Scientific Q Exactive UHMR Hybrid Quadrupole‑Orbitrap v režimu Direct Mass Technology (Orbitrap‑CDMS). Akvizice trvala obvykle 1–2 minuty na měření.

Zpracování dat: STORIboard (build 1.0.24204.1) se používá pro detekci stop a výpočet molárních hmotností (MDa) a procentuálních podílů kapsid (prázdné, částečně naplněné, naplněné, přenaplněné). Klíčové parametry STORIboard zahrnují:

• R2 threshold: 0.99
• Duration threshold: 0.1
• Minimum time of death: 0.2
• Minimum time of birth: 0.1
• Signal-to-noise threshold: 1
• Apply frequency correction: True
• Charge assignment (central limit), number averaged ions: 1, m/z tolerance: 50

Optimální parametry Q Exactive UHMR doporučené autory (shrnutí):

• Ion transfer tube teplota: 350 °C
• Source DC offset: 0 V
• In‑source trapping (desolvation): −10 V
• Injection flatapole (DC): 4 V
• Interflatapole lens: 3 V
• Bent flatapole: 2 V
• Extended (HCD) trapping: 5 eV
• Trapping gas: cca 5.0 × 10−10 mbar
• HCD purge time: 15 ms
• HCD field gradient: 65

Hlavní výsledky a diskuse

Vliv parametrů: většina zkoumaných parametrů (např. teplota, HCD purge time, HCD field gradient, extended trapping, trapping gas v širokém rozmezí) měla minimální vliv na vypočtený poměr prázdných/naplněných kapsid. Dva parametry však vykazovaly výrazný systematický vliv:

1) In‑source trapping (desolvation) voltage: zvyšování napětí v in‑source části způsobovalo významný nárůst vykazovaného podílu prázdných kapsid (tedy ztrátu plných kapsid). Interpretace je, že vyšší injekční energie zhoršuje radiální udržení iontů vysokého m/z, což vede k selektivní ztrátě těžších (naplněných) částic.

2) Injection flatapole RF voltage: RF napětí na vstupním flatapolu ovlivňuje radiální konfinační pole; vyšší RF zlepšuje zachycení a převedení vysokého m/z iontů, čímž snižuje zkreslení vůči naplněným kapsidám. Při nižším RF bylo pozorováno značné snížení průměrného počtu plných kapsid na spektrum a tím i bias směrem k vyšším podílům prázdných.

Sensitivity vs. přesnost: některé nastavení nemění měřený poměr, ale ovlivňují citlivost (průměrný počet iontů na spektrum). Například source DC offset = 0 V se doporučuje jako kompromis mezi přesností poměru a citlivostí. Trapping gas a source DC offset vykazují m/z závislé účinky na počtech iontů.

Reprodukovatelnost: za doporučených nastavení byly měření poměrů prázdných/naplněných reprodukovatelné napříč třemi serotypy (AAV2, AAV8, AAV9), třemi objemovými směsmi (25/50/75 % prázdných) a na více instrumentech. Opakovatelné výsledky potvrzují, že vhodná kombinace nízkého in‑source trappingu a dostatečného injection RF minimalizuje systematické chyby.

Role zpracování signálu: nová vylepšení v signálovém zpracování (publikované metody) umožňují korekci za neúplné desolvace a posun hmotnosti iontů, což zvyšuje přesnost CDMS pro těžké biologické komplexy.

Přínosy a praktické využití metody

Výhody použití Direct Mass Technology na Q Exactive UHMR pro AAV analýzu:

• Rychlé měření (minuty) oproti hodinám u AUC.
• Nízká spotřeba vzorku (řádově nižší než u AUC), vhodné pro vzácné nebo drahé přípravky.
• Přímé určení molární hmotnosti a identifikace populačních frakcí (prázdné, částečně naplněné, naplněné, přenaplněné).
• Možnost použití v kontrolách kvality, vývoji procesu a při validaci výrobních kroků.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry rozvoje a rozšíření aplikace:

• Další zlepšení signálového zpracování a algoritmů CDMS pro korekci hmotnostních posunů a neúplné desolvace.
• Širší nasazení těžších plynů v HCD pro optimalizaci zachytávání velmi velkých komplexů tam, kde to infrastruktura dovolí.
• Standardizace metodiky a kalibračních standardů pro regulované nasazení v průmyslové kontrole kvality biologických vektorů.
• Rozšíření přístupu CDMS na jiné viry a velké biologické komplexy, integrace s workflow náboru kandidátů a stability studií.
• Potenciální akceptace výsledků CDMS regulačními orgány, pokud budou dostupné standardy a validační studie.

Závěr

Q Exactive UHMR v režimu Direct Mass Technology poskytuje spolehlivou, rychlou a citlivou alternativu k tradičním metodám pro kvantifikaci prázdných a naplněných AAV kapsid. Klíčové je optimalizovat in‑source trapping a injection flatapole RF, spolu se vhodnou kombinací dalších parametrů (source DC offset = 0, doporučená teplota ion transfer tube atd.), aby se minimalizovalo systematické zkreslení vůči plným částicím. Správné nastavení a moderní zpracování dat vedou k přesným a reprodukovatelným výsledkům napříč serotypy a instrumenty, což činí metodu silným nástrojem pro vývoj a kontrolu kvality vektorových produktů.

Reference

1. Daya S.; Berns K.I. Gene therapy using adeno-associated virus vectors. Clinical Microbiology Reviews 2008, 21(4), 583–593.
2. Werle A.K.; Powers T.W.; Zobel J.F.; Wappelhorst C.N.; Jarrold M.F.; Lyktey N.A.; Sloan C.D.K.; Wolf A.J.; Adams-Hall S.; Baldus P.; Runnels H.A. Comparison of analytical techniques to quantitate the capsid content of adeno-associated viral vectors. Molecular Therapy Methods & Clinical Development 2021, 23, 254–262.
3. Mietzsch M.; Liu W.; Ma K.; Bennett A.; Nelson A.R.; Gliwa K.; Chipman P.; Fu X.; Bechler S.; McKenna R.; Viner R. Production and characterization of an AAV1-VP3-only capsid: An analytical benchmark standard. Molecular Therapy Methods & Clinical Development 2023, 29, 460–472.
4. Fort K.L.; van de Waterbeemd M.; Boll D.; Reinhardt-Szyba M.; Belov M.E.; Sasaki E.; Zschoche R.; Hilvert D.; Makarov A.A.; Heck A.J.R. Expanding the structural analysis capabilities on an Orbitrap-based mass spectrometer for large macromolecular complexes. Analyst 2018, 143, 100–105.
5. Goodwin M.P.; Grinfeld D.; Yip P.; Bowen K.P.; Kafader J.O.; Kelleher N.L.; Senko M.W. Improved signal processing for mass shifting ions in charge detection mass spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry 2024, 35, 658–662.