Optimizing Mass Spectrometer Conditions to Accurately Determine Full/Empty AAV Ratios: A Sample Half-Full Approach

Význam tématu

Analýza poměru plných a prázdných kapsid adeno-asociovaných virů (AAV) je klíčová pro kontrolu kvality v gene­terapii. Správné stanovení podílu kapsid nesoucích cílový genomet minimalizuje rizika vedlejších účinků a zvyšuje účinnost léčby. Orbitrap založená charge‐detection hmot­nostní spektrometrie nabízí rychlou a citlivou alternativu k ultracentrifugaci s malým objemem vzorku.

Cíle a přehled studie

Cílem práce bylo identifikovat klíčové instrumentální parametry na hmotnostním spektrometru Q Exactive UHMR, které ovlivňují přesnost měření poměru plných/prázdných AAV2, a definovat optimální nastavení pro reprodukovatelné výsledky.

Použitá metodika

Vzorky AAV2 s definovaným poměrem 50 % a 75 % prázdných kapsid připravené v 200 mM octanu amonném byly analyzovány metodou CDMS v režimu Direct Mass Technology. Iontizace probíhala elektrospraye­m s napětím ~1,2 kV. Spektra byla vyhodnocena softwarem STORIboard pro rozlišení frakcí prázdných, plných a přeplněných kapsid.

Použitá instrumentace

• Hmotnostní spektrometr Thermo Scientific Q Exactive UHMR Hybrid Quadrupole‐Orbitrap
• Nanospray Flex ion source (Thermo Scientific)
• Software STORIboard (Proteinaceous)

Hlavní výsledky a diskuse

Analýza citlivosti parametrů ukázala, že většina nastavení (trapping gas, HCD purge time, HCD field gradient) má minimální vliv na poměr plných/prázdných kapsid. Významně ovlivňují výslednou přesnost tyto tři parametry:

• In-source trapping (desolvation) voltage – zvýšení napětí vede k podhodnocení plných kapsid, neboť těžší ionty jsou více ztráceny.
• Injection flatapole RF voltage – vyšší RF napětí zlepšuje radialní zadržení iontů, nižší napětí však umožňuje lepší vyvážení citlivosti mezi prázdnými a plnými kapsidami.
• Source DC offset – extrémní hodnoty mohou ovlivnit přenos plných kapsid, ačkoliv vliv je menší než u předchozích parametrů.

Kombinací optimalizovaných parametrů bylo dosaženo přesného stanovení plných/prázdných poměrů do 1–2 % od známých hodnot při reprodukovatelnosti pod 5 % RSD.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda poskytuje několikadvacetiminutové vyhodnocení poměru plných a prázdných kapsid s nutným objemem vzorku pod 1 µL. To umožňuje rychlou kontrolu kvality výrobních šarží AAV v průmyslové i výzkumné praxi, minimalizuje spotřebu materiálu a šetří čas proti tradiční AUC.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se integrace zlepšených algoritmů pro detekci těžkých komplexů do STORIboard, dále vývoj zmrazených inkorporací pro stabilnější měření a automatizace přípravy vzorku. Rozšíření na další vektorové platformy a multiplexní analýzu směsí různých serotypů AAV otevírá nové možnosti pro vývoj a validaci genových terapií.

Závěr

Optimalizace in-source trapping a injection flatapole RF napětí na Q Exactive UHMR vede k přesnější a reprodukovatelné kvantifikaci plných/prázdných AAV kapsid. Metoda přináší rychlé a účinné řešení pro kontrolu kvality v gene­terapii s nízkou spotřebou vzorku.

Reference

1. Fort K.L., van de Waterbeemd M., Boll D., Reinhardt-Szyba M., Belov M.E., Sasaki E., Zschoche R., Hilvert D., Makarov A.A., Heck A.J.R.: Expanding the structural analysis capabilities on an Orbitrap-based mass spectrometer for large macromolecular complexes. Analyst 143, 100–105 (2018).