Gas phase affinity selection-native mass spectrometry for automated ligand screening

Význam tématu

Analýza ligand‑cílových interakcí je klíčová v raných fázích vývoje léčiv a v strukturální biologii. Rychlé, spolehlivé a škálovatelné metody umožňují vyselektovat sloučeniny s požadovanou afinitou, specifičností a stabilitou a tím zkrátit čas a náklady na vývoj kandidátů. Native mass spectrometry (native MS) nabízí přímé informace o nerozložených protein‑ligand komplexech (stoichiometrie, síla vazby) a v kombinaci s chromatografickými postupy a automatizací umožňuje vysokopropustné skríningové platformy.

Cíle a přehled studie

Studie představuje integrovaný workflow kombinující automatizované online odsíťování pufru (online buffer exchange), frakční kolekci a přímou native MS analýzu pro automatizované vyhledávání ligandů. Cílem bylo zvýšit průchodnost (throughput), zlepšit zachování slabších vazeb a umožnit identifikaci a strukturální vysvětlení navázaných ligandů pomocí MSn (včetně MS3). Jako modelový systém byla použita karbonanhydráza (CA) se známou sadou sulfonamidových inhibitorů.

Použitá metodika

• Příprava: CA ve 200 mM amonném acetátu; ligandy rozpuštěny v DMSO (10 nebo 100 mM). Směsi proteinů byly desaltingovány online přes NativePac OBE‑1 SEC kolonu a frakcionovány do 96‑well desek, kde byly předem naloženy jednotlivé ligandy (post‑column binding).
• Porovnání přístupů: vyhodnoceno pre‑column (ligand přítomen před SEC) versus post‑column (ligand přidán až po desaltingu). Post‑column binding minimalizoval on‑column dissociaci slabých vazeb.
• Detekce a kvantifikace: přímá infuze frakcí do Orbitrap Ascend Structural Biology Tribrid nebo Q Exactive UHMR; měření v rozsahu m/z 1 500–6 000 (MS1) s vysokým rozlišením (např. 240 000 při m/z 200) a následné uvolňování ligandů kolizní energií (MS2 HCD) a fragmentace (MS3 CID) pro strukturální informace.
• Výpočet apparent Kd: založen na frakčním zastoupení komplexu vs. volného proteinu při sérii koncentrací ligandů; údaje zpracovány v BioPharma Finder 5.0 a vyhodnoceny v GraphPad Prism.
• Gas Phase Affinity Selection MS: izolace nativního komplexu v kvadrupólu, jeho disociace ve vakuové fázi a následná detekce a fragmentace uvolněných ligandů v Orbitrapu/ion trapu pro rychlou identifikaci v multiplexovaných vzorcích.

Použitá instrumentace

• Chromatografie a automatizace: Thermo Scientific Vanquish LC systém s UV detektorem, frakčním kolektorem, duálním autosamplerem a duálními Vanquish Flex pumpami.
• Odsíťování (online buffer exchange): Thermo Scientific NativePac OBE‑1 SEC kolona.
• Ionizace: EASY‑Spray kapilární bullet emitter (15 µm ID) a EASY‑Spray zdroj pro kapilární ESI.
• Hmotnostní spektrometry: Thermo Scientific Orbitrap Ascend Structural Biology Tribrid MS; doplňkově Thermo Scientific Q Exactive UHMR Hybrid Quadrupole‑Orbitrap MS.
• Software a zpracování dat: Thermo Scientific BioPharma Finder 5.0; GraphPad Prism pro Kd výpočty.
• Konzumabilie: amonný acetát, LC‑MS voda, skleněné insertní mikrovíčka, 384‑well Protein LoBind desky apod.

Hlavní výsledky a diskuse

• Post‑column binding výrazně redukoval on‑column dissociaci slabších vazeb ve srovnání s klasickým pre‑column přístupem, což umožnilo detekci ligandů s vyššími off‑ráty (přibl. Kd v µM rozsahu), například u některých sulfonamidových inhibitorů CA.
• Automatizovaný workflow umožnil průchodnost přibližně 300 vzorků za den při režimu 1 ligand/well, což je významné zlepšení oproti tradičním manuálním native MS postupům.
• Apparent Kd hodnoty odvozené z frakční abundance komplexů byly v souladu s publikovanými Kd hodnotami pro testované ligandy (L1–L4), potvrzující kvantitativní věrohodnost přístupu.
• Gas Phase Affinity Selection MS umožnila multiplexování (více ligandů ve stejné jámě), izolaci komplexu v kvadrupólu a uvolnění ligandů v plynné fázi pro následné MSn identifikace. Tento přístup zvýšil throughput a usnadnil rozlišení navázaných ligandů i v situacích, kde jsou molekulové hmotnosti ligandů podobné nebo přítomny addukty/cofaktory.
• Při uvolňování ligandů se ukázalo, že některé uvolněné ionty v plynné fázi jsou v negativním ionovém módu lépe detekovatelné; použitím MS3 byla identifikována neznámá nečistota jako dibenzenedisulfonamid s přidaným Cl (-HCl adiční rozdíl ~35.977 Da).

Přínosy a praktické využití metody

• Umožňuje rychlé a automatizované skríningy ligandů se zachováním nativní konformace proteinu a komplexní stoichiometrie.
• Post‑column přístup chrání slabé vazby před chromatografickou dissociací a rozšiřuje detekovatelný rozsah Kd.
• Gas Phase Affinity Selection MS zvyšuje multiplexing a průchodnost bez nutnosti separace každého ligandu samostatně, přičemž MSn poskytuje strukturální informace pro identifikaci hitů a nečistot.
• Praktické nasazení v screeningových laboratořích, v projektech cílené degradace proteinů (ternární komplexy) a při rychlé validaci kandidátů z HTS knihoven.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Dále prohloubená automatizace a integrace s robotikou umožní škálovat screening na větší sbírky sloučenin a zkrátit dobu cyklu vývoje kandidátů.
• Propojení s pokročilou analýzou dat (automatizované dekonvoluce, strojové učení) zefektivní výběr relevantních hitů a sníží falešně pozitivní výsledky.
• Rozšíření workflow o iontově‑mobilitní separaci by mohlo zlepšit rozlišení izobarických ligandů a aduktů přímo v plynné fázi.
• Využití vyšších pořadí MSn a kombinace s chromatografickými technikami (RPLC pro identifikaci malých molekul) umožní komplexnější charakterizaci navázaných látek i nečistot.
• Aplikace na screening komplexních biologických systémů, včetně studia ternárních komplexů a degraderů (PROTACs), kde je vazba dynamická a vyžaduje citlivé nativní metody.

Závěr

Integrovaný LC–native MS workflow s online buffer exchange, post‑column multiplexním vázáním a gas‑phase affinity selection MS představuje funkční a průchodný přístup pro automatizovaný ligand screening. Metoda zlepšuje zachování slabých vazeb, umožňuje kvantifikaci apparent Kd v souladu s literaturou a poskytuje prostředky pro identifikaci navázaných ligandů pomocí MSn. Kombinace vyšší throughput, automatizace a možnosti strukturní elucidace činí tento přístup atraktivním pro akademická i průmyslová screeningová centra.

Reference

1. Ren C., Bailey A.O., VanderPorten E., Oh A., Phung W., Mulvihill M.M., Harris S.F., Liu Y., Han G., Sandoval W. Quantitative determination of protein‑ligand affinity by size exclusion chromatography directly coupled to high‑resolution native mass spectrometry. Anal. Chem. 2019, 91(1), 903–911.
2. Bui D.T., Li Z., Kitov P.I., Han L., Kitova E.N., Fortier M., Fuselier C., Granger Joly de Boissel P., Chatenet D., Doucet N., Tompkins S.M., St‑Pierre Y., Mahal L.K., Klassen J.S. Quantifying biomolecular interactions using Slow Mixing Mode (SLOMO) nanoflow ESI‑MS. ACS Cent. Sci. 2022, 8(7), 963–974.
3. Sternicki L.M., Poulsen S.A. Native mass spectrometry: Insights and opportunities for targeted protein degradation. Anal. Chem. 2023, 95(51), 18655–18666.
4. Krishnamurthy V.M., Kaufman G.K., Urbach A.R., Gitlin I., Gudiksen K.L., Weibel D.B., Whitesides G.M. Carbonic anhydrase as a model for biophysical and physical‑organic studies of proteins and protein‑ligand binding. Chem. Rev. 2008, 108(3), 946–1051.
5. Iyer R., Barrese A.A. 3rd, Parakh S., Parker C.N., Tripp B.C. Inhibition profiling of human carbonic anhydrase II by high‑throughput screening of structurally diverse, biologically active compounds. J. Biomol. Screen. 2006, 11(7), 782–791.
6. Angeli A., Pinteala M., Maier S.S., Simionescu B.C., Da'dara A.A., Skelly P.J., Supuran C.T. Sulfonamide inhibition studies of an α‑carbonic anhydrase from Schistosoma mansoni. Int. J. Mol. Sci. 2020, 21(5), 1842.