Multi-dimensional high-throughput molecular glue screening via gas phase affinity selection native mass spectrometry and cryo-EM analysis

Význam tématu

Targetované degradační strategie založené na molecular glues (MG) představují zásadní krok ve vývoji léčiv, protože umožňují degradaci dříve „nedrogovatelných" proteinů prostřednictvím zvýšení slabých, přechodných interakcí mezi cílovým proteinem a E3 ligázou. Rychlé a spolehlivé screeningové platformy, které dokážou přímo detekovat terciární komplexy (E3–MG–cíl), zrychlí identifikaci kandidátů a sníží počet falešně negativních výsledků vznikajících při konvenčních on‑column affinity selekcích.

Cíle a přehled studie / článku

Studie popisuje integrovaný přístup kombinující LC‑native MS s „gas‑phase affinity selection“ a doplňující cryo‑EM analýzu pro vysoko-propustný screening molecular glue, konkrétně pro systém CRBN‑DDB1 (E3 komplex) a WEE1 (cílový protein). Cíle byly: zvýšit propustnost měření (počty sloupců/den), umožnit identifikaci slabě vázajících ligandů a potvrdit vazby pomocí hmotnostní spektrometrie v kombinaci s strukturální analýzou.

Použitá metodika a instrumentace

Popis metodologie:

• Příprava: CRBN‑DDB1 a WEE1 smíchané v poměru objemů 1:1 (molem přibližně 1:2), koncentrace CRBN‑DDB1 ~3,3 μM, WEE1 ~6,6 μM. Skladové roztoky sloučenin 10 mM, ředěné do 200 mM ammonium acetátu (AmAc).
• Formáty screeningu: jedno‑sloučeninové studny (1 compound/well, 96 injekcí) a multiplexing (až 4 compoundy/well, 24 injekcí pro 96 sloučenin) testován pro zvýšení propustnosti.
• Časy: online buffer exchange ~0,7 min/run, MS analýza ~1,5 min/run; pro rychlé inkubace byla vyhodnocena i 5min inkubace při 25 °C versus 1 h inkubace.
• Gas‑phase affinity selection workflow: plná injekce do Orbitrapu (OT), izolace komplexu v Q1, disociace komplexu ve FHCD (pro uvolnění ligandů), detekce disociovaných komplexů a ligandů v OT, následné fragmentační MS/MS disociovaných ligandů v ion‑trap (IT) pro strukturální informaci.

Použitá instrumentace:

• Thermo Scientific Orbitrap Ascend Structural Biology Tribrid mass spectrometer.
• Parametry: m/z rozsah 50–16 000; kvadrupól až do m/z 8 000; režimy: native MS, native top‑down; fragmentační metody: PTCR, HCD, CID, ETD, UVPD.
• Datové nástroje: ProSight Native pro analýzu top‑down a nativních spekter.

Hlavní výsledky a diskuse

Klíčová zjištění:

• Platforma umožňuje přímou detekci E3–MG–cílový komplex v nativních podmínkách po rychlém online buffer exchange, čímž se minimalizuje ztráta slabě vázajících ligandů způsobená on‑column dissociací.
• Gas‑phase affinity selection MS umožňuje identifikovat vázané ligandy uvolněné v plynné fázi a následnou fragmentací v IT poskytuje strukturální informace k identifikaci neznámých binderů.
• Porovnání inkubací: výsledky po 1 h při 25 °C a po 5 min při 25 °C byly porovnatelné, což naznačuje rychlé ustavení vazeb v tomto systému a možnost zkrácení inkubace pro vysokou propustnost.
• Screening 96 sloučenin (jeden ligand na studnu) vedl k identifikaci 16 potenciálních molekulárních glue (≈16,7 % hit rate) pro systém CRBN‑DDB1–WEE1.
• Multiplexing (4 compoundy/well) snižuje počet injekcí, ale přináší riziko kompetice mezi ligandy a komplikace při interpretaci výsledků, zejména pokud mají ligandy podobné molekulové hmotnosti nebo vytváří addukty/cofaktory, které komplikují dekonvoluci spekter.

Diskuse problémů a limitací:

• Nevýhody AmAc a jiných nevolatilních příměsí mohou ovlivnit stabilitu komplexu v nativních podmínkách; online buffer exchange řeší částečně tuto překážku.
• Ambiguity při přiřazení vázaného ligandu vznikají, když je ΔM spektra těsně kolem rozdílů molekulových hmotností podobných sloučenin, nebo při přítomnosti aduktů a kofaktorů; gas‑phase fragmentace a MS/MS jsou nezbytné pro rozlišení.

Přínosy a praktické využití metody

Praktické přínosy:

• Rychlost: systém s kombinací OBE + native MS umožňuje výrazné zkrácení času na jednu analýzu (součet ~2,2 min/analýzu v popsaném nastavení), což při optimalizaci workflow může vést k průchodu stovek až tisíců sloučenin denně; autoři uvádějí možnost >2 500 sloučenin/den při maximální optimalizaci.
• Citlivost na ternární komplexy: přímé pozorování kompletního komplexu umožňuje snížit počet falešně negativních výsledků, když jsou vazby slabé nebo přechodné.
• Identifikace ligandů: gas‑phase release a fragmentace dává rychlou cestu k identifikaci neznámých binderů bez potřeby separačního kroku před MS/MS.
• Kompatibilita s následnou validací: vybrané hity lze rychle ověřit strukturálně pomocí cryo‑EM, která poskytne prostorovou informaci o interakcích v ternárním komplexu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry rozvoje:

• Dále zvyšování automatizace a robotizace přípravy vzorků a přenosu do autosampleru pro dosažení hromadné propustnosti v tisících sloučenin/den.
• Integrace výpočetních metod (strojové učení, chemoinformatika) pro prioritizaci knihoven a snížení potřeby experimentálních testů u méně pravděpodobných kandidátů.
• Pokročilé kombinace fragmentačních metod (ETD/UVPD/HCD) pro lepší rozlišení izobarických ligandů a studium mapy vazeb v plynné fázi.
• Širší využití nativního top‑down přístupu pro charakterizaci modifikací proteinů a přesnější popis heterogenity komplexů.
• Rozšíření na další E3 ligázy a cílové proteiny, inkl. membránových a multisubunitních komplexů, spolu s kompatibilitou pro vyšší molární hmotnosti.

Závěr

Studie demonstruje praktickou, rychlou a multifunkční platformu pro screening molecular glues kombinující LC‑native MS s gas‑phase affinity selection a doplňkovou cryo‑EM validací. Metoda snižuje ztráty slabě vázajících ligandů způsobené tradičními separačními postupy, umožňuje identifikaci vázaných ligandů pomocí plynné fáze a poskytuje vysokou propustnost vhodnou pro discovery projekty. Uvedený přístup nalezl 16 potenciálních hitů z 96 testovaných sloučenin pro systém CRBN‑DDB1–WEE1 a ukazuje slibnou cestu pro další rozvoj v oblasti degradačních léčiv.

Reference

Autoři a affiliace: Weijing Liu; Kheewoong Baek; Albert Konijnenberg; Wenfei Song; Christopher Mullen; Yuan Xiong; Ken Durbin; Shane Bechler; Eric Fischer; Rosa Viner; Thomas Moehring. Thermo Fisher Scientific; Dana‑Farber Cancer Institute; Harvard Medical School; Proteinaceous. Rok a další bibliografické údaje dle původního dokumentu.