Studying protein-drug complexes under native conditions in the low nM range using MRMS

Význam tématu

Analýza protein-ligand komplexů za nativních podmínek je klíčová pro objevování léčiv a pochopení biologických interakcí. Vysoké rozlišení MRMS umožňuje zachovat nekovalentní vazby a detekovat affinitu v rozsahu nízkých nanomolarů.

Cíle a přehled studie

Studie se zaměřila na karboničnou anhydrázu II v komplexu s acetazolamidem. Hlavními cíli bylo stanovení disociační konstanty Kd v nízkých nM koncentracích a přesné určení monoisotopických hmotností komplexu.

Použitá metodika a instrumentace

• Příprava CA II v amoniakálním acetátovém pufru 10 mM pH 7, koncentrace 5 a 20 nM
• Acetazolamid připraven v 50 mM amoniakálním acetátu
• Infuze se sérií pomocí ESI v pozitivním modu na scimaX MRMS (Bruker Daltonik)
• Masa m/z 300–4000, rozlišení 70 000, 200 sumovaných skenů, iontová akumulace 7 s
• Dekonvoluce dat pomocí MaxEnt a SNAP2

Hlavní výsledky a diskuse

• Isotopicky rozlišená spektra volné CA II a CA II–acetazolamid komplexu při 5 nM proteinu a různých koncentracích ligandu
• Kd vypočtené 43 +-7 nM pro 5 nM proteinu a 52 +-12 nM pro 20 nM, shodné s literární hodnotou 20 nM
• Průměrná chyba monoisotopické hmotnosti ligandu 6,9 mDa (5 nM) a 3,6 mDa (20 nM)

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá a kvantitativní analýza vazby v nízkých nanomolarních koncentracích
• Zachování nativní struktury bez potřeby modifikace proteinu
• Možnost přímé vizualizace nespecifických vazeb a specifické interakce pro různé izoformy

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozvoj citlivosti a rozlišení MRMS pro vysoce propustné screeningové assay. Integrace s automatizovanými platformami a zdokonalení softwarové analýzy dat otevře nové perspektivy v farmaceutickém průmyslu, QC a biotechnologiích.

Závěr

Native MRMS na přístroji scimaX nabízí vysokou senzitivitua při zachování nekovalentních interakcí v nízkých nM koncentracích. Metoda umožňuje přesné stanovení monoisotopických hmotností a kvantitativní hodnocení afinity protein–ligand, což urychluje vývoj nových léků.

Reference

• Pedro L Quinn RJ Native Mass Spectrometry in Fragment-Based Drug Discovery Molecules 21 984 2016
• Ganem B Tsyrli Y Henion JD Detection of non-covalent receptor-ligand complexes by mass spectrometry J Am Chem Soc 113 6294 1991
• Hofner G Wanner K Competitive binding assays made easy with a native marker J Angew Chem Int Ed Engl 42 5235 2003
• Chrysanthopoulos PK Mujumdar P Woods LA Dolezal O Ren B Peat TS Poulsen SA Identification of a New Zinc Binding Chemotype J Med Chem 60 7333 2017
• Iyer R Barrese AA Parakh S Parker CN Tripp BC Inhibition Profiling of Human CA II Journal of Biomolecular Screening 11 782 2006