Evaluating Volume Effects in SEC for Large Biomolecules on the Alliance™ iS Bio System With GTxResolve™ SEC 2000 Å Columns

Význam tématu

Analytická velikostně vylučovací chromatografie (SEC) je klíčová pro hodnocení heterogenity biologických léčiv podle velikosti (agregáty, vysokomolekulární druhy, fragmenty). S rostoucím nasazením nukleových kyselin jako léčebných modalit je nutné zajistit, aby SEC metody spolehlivě popisovaly jak proteiny, tak plasmidy/vektory. Studie hodnotí, jak metodické parametry (ionicita mobilní fáze, injikované množství) a hardware (delší široko-průměrový SEC sloupec, bio-inertní průtoková dráha) ovlivňují interpretaci SEC profilů pro velké biomolekuly.

Cíle a přehled studie / článku

Hlavní cíle byly:

• Porovnat chování velkých proteinů a nukleových kyselin na jednotném SEC formátu (GTxResolve 2000 Å, 7.8×300 mm) provozovaném na platformě Alliance iS Bio.
• Ověřit vliv zvýšené iontové síly (1× DPBS vs 1× DPBS + 1.0 M NaCl) na profily proteinů a plasmidů.
• Testovat vliv enzymatické relaxace DNA (topoisomeráza I) na tvar plasmidních špiček a ramének.
• Posoudit linearitu UV signálu při zvětšeném injikovaném objemu jako praktický prostředek zvýšení citlivosti.

Použitá metodika a instrumentace

Krátké shrnutí metodiky:

• Sloupec: GTxResolve 2000 Å, MaxPeak Premier, 3 µm, 7.8×300 mm (šířší a delší než předchozí 4.6×150 mm formát pro zvýšenou separační kapacitu a headroom pro objem injekce).
• Instrumentace: Alliance iS Bio HPLC System s integrovaným PDA detektorem a bio-inertním průtokovým systémem; analytická kyveta 8.4 µL, 10 mm dráha, měření při 20 Hz, rozlišení 1 nm.
• Mobilní fáze: 1× DPBS (bez Ca/Mg); komparace s 1× DPBS doplněným o 1.0 M NaCl.
• Provozní podmínky: tok 0.60 mL·min−1, teplota sloupce 35 °C, teplota vzorků 2–8 °C, běh ~31 min na injekci.
• Vlnové délky: 280 nm pro proteiny, 260 nm pro DNA; data zpracována v Empower 3.10.x.
• Vzorky: thyroglobulin (2 mg·mL−1), BEH450 proteinový standard (triplikáty), Waters DNA Vector Mixture (pBR322 dsDNA, ΦX174 ssDNA, uracil), a verze vzorku ošetřená topoisomerázou I.
• Injekční objemy: standardně 50 µL; studie linearity pro proteiny 25–100 µL a pro DNA 12.5–100 µL.

Hlavní výsledky a diskuse

Proteiny:

• Metoda vykázala vysokou opakovatelnost: triplikáty BEH450 v 1× DPBS měly téměř shodné retenční časy a tvary píků napříč molekulovými hmotnostmi (thyroglobulin, IgG, BSA, myoglobin, uracil).
• Thyroglobulin při 25–100 µL zachoval dobře definované oligomerní, dimerové a monomerní špičky a celková plocha rovnoběžně rostla s injikovaným objemem — lineární UV odpověď, rozdíl plochy mezi DPBS a DPBS+1.0 M NaCl byl <4 %.

Plasmidy / DNA vektory:

• Přesun na 7.8×300 mm sloupec rozšířil separační prostor a umožnil objevit detailní raménkovou strukturu (shoulders) v regionech pBR322 a ΦX174 při vyšším zatížení (50 µL), jež byly méně zřetelné v kratším formátu.
• Zvýšení iontové síly (přidáním 1.0 M NaCl) potlačilo tyto raménka, čímž chromatogramy vypadaly „jednodušeji“; to naznačuje, že některé píkové podstruktury jsou metodou závislé.
• Enzymatické ošetření topoisomerázou I (relaxace supercoilů) ve stejných DPBS podmínkách vedlo ke srovnatelnému snížení ramének (pokles ploch o ~41–52 % ve vybraných regionech), což potvrzuje, že část struktury píků vyplývá z konformačních/topologických stavů plasmidů spíše než z chromatografických artefaktů.
• Injekční objem pro DNA v rozmezí 12.5–100 µL zachoval lineární zvýšení ploch píků, čímž prokázal, že širší/delší formát poskytuje reálný headroom pro zvýšení citlivosti bez ztráty kvantitativní fidelity.

Přínosy a praktické využití metody

Hlavní přínosy:

• Jednotná platforma (Alliance iS Bio + GTxResolve 7.8×300 mm) umožňuje současnou analýzu proteinů i velkých nukleových kyselin bez potřeby složitého přepínání hardware.
• Bio-inertní povrchy (MaxPeak HPS) a inertní průtoková dráha minimalizují nespecifické adsorpce a artefakty, což je důležité při analýze náchylných biologických makromolekul.
• Možnost zvýšit injikovaný objem a přesto zachovat lineární odezvu rozšiřuje praktickou citlivost metody bez nutnosti měnit jádro SEC protokolu.
• Schopnost rozlišit konformačně odlišné podpopulace plasmidů (pomocí soli a topoisomerázy jako ortogonálních podmínek) zlepšuje výklad chromatogramů a může pomoci QC při charakterizaci a kontrole kvality vektorů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Možné směry dalšího rozvoje a využití:

• Integrace SEC s dalšími ortogonálními technikami (např. MALS, DLS, AUC nebo hmotnostní spektrometrie) pro kvantitativní určení molární hmotnosti a potvrzení konformačních změn plasmidů.
• Optimalizace mobilních fází a povrchových modifikací sloupců pro minimalizaci metodické závislosti plasmidních profilů, zvláště v QC prostředí.
• Vývoj datových workflow a deconvolučních algoritmů zaměřených na rozlišení a kvantifikaci ramének a subpopulací plasmidů identifikovaných při vysokém zatížení.
• Uplatnění širších/delších SEC formátů pro validaci a standardizaci analýzy vektorů v průmyslových výrobních a kontrolních laboratořích.

Závěr

Studie ukázala, že použití GTxResolve 2000 Å sloupce v 7.8×300 mm provedení na Alliance iS Bio systému poskytuje vysoce reprodukovatelné a citlivé SEC separace pro proteiny i velké nukleové kyseliny. Proteiny byly vůči změnám iontové síly stabilní, zatímco plasmidy vykazovaly metodě citlivé konformační rysy, které lze ortogonálně ověřit enzymatickou relaxací DNA. Zvýšený objem injekce je efektivní prostředek ke zvýšení citlivosti bez ztráty lineárity signálu. Výsledky podtrhují, že pro robustní charakterizaci plasmidních produktů je nutné volit a dokumentovat metodické podmínky s ohledem na to, jak mohou maskovat nebo odhalovat biologicky relevantní podpopulace.

Reference

1. Arakawa T., Ejima D., Li T., Philo J. S. The critical role of mobile phase composition in size exclusion chromatography of protein pharmaceuticals. J. Pharm. Sci. 2010, 99(4), 1674–1692.
2. Wang J. C. Cellular roles of DNA topoisomerases: a molecular perspective. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2002, 3(6), 430–440.
3. Champoux J. J. DNA topoisomerases: structure, function, and mechanism. Annu. Rev. Biochem. 2001, 70, 369–413.
4. Finny A. S., Reidy C., Addepalli B., Lauber M. A. High-Resolution Size Exclusion Chromatography of Megadalton-Sized DNA Vectors and Plasmids Using Waters GTxResolve 2000 Å SEC Columns. Waters Application Note, 720008847, 2025.
5. Koza S. M., Reed C. E., Chen W. Evaluating the Impact of LC System Dispersion on the Size-Exclusion Chromatography Analysis of Proteins. Waters Application Note, 720006337, 2019.