Routine Monitoring of DNA/mRNA Therapeutics With the Alliance™ iS Bio HPLC System and Ultra Wide-Pore GTxResolve™ Premier SEC Column

Význam tématu

Vývoj genové terapie, včetně mRNA vakcín, vyžaduje spolehlivé a citlivé analytické metody k detekci agregátů a hustoty molekul. Velikostní vylučovací chromatografie (SEC) hraje klíčovou roli při charakterizaci velikostních variant bioterapeutik, přičemž přesná separace velkých mRNA molekul a jejich agregátů závisí na dostatečném objemu pórů chromatografické kolony a na co nejnižší disperzi systému.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem této studie bylo porovnat výkonnost nového HPLC systému Alliance iS Bio s ultra-širokopórovou SEC kolonou GTxResolve Premier vůči tradičním platformám (ACQUITY Premier UPLC a Alliance e2695 HPLC) pro rutinní QC analýzu DNA/mRNA terapeutik. Hlavním ukazatelem byla extra-column disperze a její dopad na rozlišení a kvalitu separace.

Použitá metodika a instrumentace

Pro separaci byla použita:

• Alliance iS Bio HPLC System (nízká disperze, inertní povrchy MaxPeak HPS)
• ACQUITY Premier UPLC System (referenční platforma s minimální extra-column disperzí)
• Alliance e2695 HPLC System (starší generace)
• SEC kolony GTxResolve Premier, 1000 Å, 3 µm ve formátech 4.6×300 mm a 7.8×300 mm
• Mobilní fáze: dvojnásobná koncentrace PBS pro DNA, Tris/KCl pro mRNA
• Vzorky: DNA žebříčky (50–1350 bp), EGFP mRNA (997 nt)

Hlavní výsledky a diskuse

Extra-column disperze (5σ) činila 12.6 µL pro ACQUITY Premier, 26.2 µL pro Alliance iS Bio a 92.0 µL pro Alliance e2695. Při separaci DNA žebříčků a mRNA byly ostré a symetrické píky na systémech s nízkou disperzí, zatímco starší systém vykazoval významné rozšíření a ztrátu rozlišení na menším průměru kolony. Zvýšení vnitřního průměru kolony na 7.8 mm u legacy systému částečně kompenzovalo disperzi, avšak za cenu vyšší spotřeby mobilní fáze.

Přínosy a praktické využití metody

Alliance iS Bio HPLC System s ultra-širokopórovou SEC kolonou umožňuje:

• Rychlou a opakovatelnou detekci mRNA monomerů, agregátů a fragmentů
• Porovnatelné rozlišení s UPLC při nižších nákladech na mobilní fázi
• Snížení celkového objemu rozptýleného piku a vyšší přesnost kvantifikace

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry vývoje zahrnují optimalizaci materiálů kolony pro ještě širší rozsah pórů, integraci SEC s hmotnostní spektrometrií pro detailní analýzu posttranslačních modifikací a aplikace ve výzkumu lipidových nanočástic jako nosičů genové terapie. Dále je perspektivní automatizace celého workflow pro on-line monitoring výroby.

Závěr

Studie potvrdila, že Alliance iS Bio HPLC System v kombinaci s GTxResolve Premier SEC kolonou poskytuje robustní, reprodukovatelné a nákladově efektivní řešení pro rutinní QC analýzu DNA/mRNA terapeutik. Nízká disperze systému umožňuje zachovat vysoké rozlišení bez nutnosti větších kolonu, což podporuje flexibilitu nasazení v laboratořích výrobních a kontrolních oddělení.

Reference

1. Le T.T. et al. The COVID-19 Vaccine Development Landscape. Nature Reviews Drug Discovery, 2020, 19, 305–306.
2. Goyon A. et al. Separation of Plasmid DNA... Anal. Chem. 2023, 95, 15017–15024.
3. Koza S.M. et al. Impact of LC System Dispersion... Waters Application Note, 2019.
4. Hong P. et al. Dwell Volume and Extra-Column Volume... Waters White Paper, 2018.
5. Hong P., Fountain K.J. Method Development for Size-Exclusion Chromatography of Monoclonal Antibodies... Waters Application Note, 2011.