Enhancing Size-Exclusion Chromatography of Large Biomolecular Analytes With Rigorously Designed GTxResolve™ Premier SEC 1000 Å 3 μm Columns

Význam tématu

SEC je klíčová technika pro rozdělení makromolekul na základě velikosti a hydrodynamického objemu. V oblasti charakterizace proteinů, nukleových kyselin a komplexních biologických látek umožňuje rychlou a spolehlivou analýzu velikostních frakcí. Optimalizace kolon a výplně je zásadní pro minimalizaci nežádoucích interakcí a dosažení vysoké reprodukovatelnosti a rozlišení, což je kritické zejména pro vývoj a kontrolu kvality bioterapeutik a cílených léčiv.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo představit a ověřit výkonnost nové řady SEC kolon GTxResolve™ Premier SEC 1000 Å 3 μm s patentovanou výplní HO-PEO a povrchovou úpravou MaxPeak™ HPS. Autoři porovnali tyto kolonové systémy s dosud běžně používanými 5 μm kolonami o stejné pórovitosti v širokém spektru biomolekulárních analytů, včetně bílkovin a dsDNA, a dále zkoumali vliv sekundárních interakcí na chromatografické parametry.

Použitá metodika a instrumentace

Analýzy byly provedeny na ACQUITY UPLC H-Class Bio systému s Quaternary Solvent Managerem a TUV detektorem. Kolony GTxResolve™ Premier SEC 1000 Å 3 μm byly testovány v rozměrech 4,6 x 150 mm a 4,6 x 300 mm. Mobilní fáze zahrnovaly pufry PBS, sodný fosfát pH 6,8, vodu a aketonitril v různé kombinaci pro posouzení adsorpce a sekundárních interakcí. Teplota kolony byla 35 °C, teplota vzorků 6 °C a objem injekce 2–20 μL podle typu analyzovaného vzorku.

Hlavní výsledky a diskuse

• Reproduk­tibilita: Kolony GTxResolve™ Premier vykázaly konzistentní chromatogramy mezi dávkami i mezi jednotlivými kolony a zcela překonaly 5 μm srovnávací kolony.
• Rozlišení a účinnost: 3 μm částice s póry 1000 Å poskytly dvojnásobný počet desek (19–20 000 vs. 9–11 000 USP desek) a výrazně lepší rozlišení mezi makromolekulárními frakcemi bílkovin i dsDNA.
• Snížené sekundární interakce: Díky vrstvě MaxPeak™ HPS a HO-PEO výplni bylo prokázáno minimální ovlivnění eluce změnami iontové síly a organickými modifikanty, s <11 % změnou faktoru špičkovatosti oproti 31 % u konvenčních kolon.

Přínosy a praktické využití metody

• Zvýšená přesnost a citlivost při kvantifikaci nečistot a agregátů v bioléčivech.
• Vysoká inertnost a reprodukovatelnost usnadňují validaci metod a zkracují dobu vývoje analýz.
• Možnost použití široké škály mobilních fází s minimálním rizikem denaturace nebo ztráty vzorku.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další miniaturizace částic a vylepšení povrchových chemistries cílené na specifické biomolekuly.
• Integrace s hyphenovanými technikami (MS, špičkový detektor více parametrů) pro komplexní charakterizaci biokomplexů.
• Automatizace a vysokoprůtokové platformy pro rutinní QC v biotechnologickém průmyslu.

Závěr

GTxResolve™ Premier SEC 1000 Å 3 μm kolony představují významný krok vpřed v oblasti SEC pro analýzu velkých biomolekul. Nabízejí lepší rozlišení, efektivitu a reprodukovatelnost oproti tradičním 5 μm kolonám a minimalizují sekundární interakce díky pokročilému povrchu. Tyto vlastnosti otevírají nové možnosti pro rychlou a spolehlivou QC, vývoj i regulaci bioterapeutik.

Reference

1. H. G. Barth a B. E. Boyes, Size Exclusion Chromatography, Anal Chem, 1990.
2. P. Hong et al., A review size-exclusion chromatography…, J. Liquid Chromatography, 2012.
3. S. Fekete et al., Investigating the secondary interactions…, J Chromatogr A, 2022.
4. A. Goyon et al., Evaluation of size exclusion chromatography columns…, J Chromatogr A, 2017.