Blueprint for QC-ready mRNA mapping with Thermo Fisher Scientific and the University of Sheffield

Význam tématu

Analýza mRNA terapeutik pomocí LC–MS/MS je kritická pro ověření identity, kvality a nečistot v průběhu vývoje i výrobních procesů. mRNA má omezený počet nukleotidů a vysokou pravděpodobnost izobarických fragmentů při úplné digesci, což ztěžuje jednoznačné mapování sekvence. Robustní, opakovatelné a škálovatelné workflow pro přímé sekvenční mapování mRNA je proto zásadní pro QA/QC a regulatorní přijetí mRNA produktů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem spolupráce mezi Thermo Fisher Scientific a Univerzitou v Sheffieldu (laboratoř prof. Marka Dickmana) bylo vyvinout plně automatizované, vysoce rozlišené LC–MS/MS workflow pro mapování mRNA, které bude reprodukovatelné, vhodné pro vysokoprostorové zpracování a připravené pro použití v QC. Studie demonstruje dvě hlavní strategie řízené částečné digesce (offline a online 2D-LC) a doplňující softwarové vizualizační nástroje pro rychlé vyhodnocení pokrytí sekvence a dalších atributů (5′ capping, délka a heterogenita poly(A)).

Použitá metodika a instrumentace

• Strategie digesce: kontrolovaná částečná digesce RNázou T1 namísto úplné digesce, což generuje delší, unikátní oligoribonukleotidy vhodné pro MS/MS sekvenování.
• Offline automatizace: KingFisher Duo Prime s SMART Digest RNase kit–enzymy imobilizovanými na magnetických částicích, které umožňují okamžité zastavení reakce odstraněním částic; vzorky pak analyzovány Vanquish LC se DNAPac RP kolonkou a Orbitrap Exploris 240/480 MS.
• Online 2D-LC: SMART Digest RNase Columns pro řízenou online částečnou digesci s možností nastavení teploty a průtoku pro reprodukovatelnost; dvourozměrné LC umožňuje současné mapování sekvence a multi-atributové měření.
• Software a vizualizace: BioPharma Finder pro zpracování HRAM dat; vlastní vizualizační nástroje čtou výstupy a tvoří lineární a spirální mapy sekvence, kombinují komplementární digesy a různé stupeň digesce pro lepší pokrytí.

Hlavní výsledky a diskuse

• Částečná, řízená digesce generuje delší a jednoznačnější fragmenty než úplná digesce, což výrazně zlepšuje unikátní pokrytí sekvence a snižuje počet izobarických shod.
• Offline automatizace (KingFisher + SMART Digest) poskytuje jednoduchou, opakovatelnou metodiku vhodnou pro high-throughput zpracování.
• Online 2D-LC přístup dosahuje přibližně 98% unikátního pokrytí sekvence za méně než 60 minut na běh, s vysokou reprodukovatelností pro retenci i signál mezi běhy.
• Bespoke vizualizační nástroje výrazně zkracují dobu analýzy z řad hodin na přibližně 10 minut na vizualizaci a umožňují kombinovat výsledky z různých enzymatických štěpení nebo různých úrovní digesce pro řešení strukturovaných oblastí mRNA.
• Platforma umožňuje multi-attribute monitoring: simultánní vyhodnocení identity, 5′ capping efektivity (~90% v příkladu), a poly(A) délky/heterogenity v rámci jedné LC–MS/MS relace.

Přínosy a praktické využití metody

• Metodika nabízí průchodný single-vendor workflow (enzymy, automatizace, LC, MS, software), což usnadňuje standardizaci, tvorbu SOP a přenos metod mezi laboratořemi.
• Vysoké unikátní pokrytí a MS/MS podpora dávají kontrolním laboratořím přímé, důvěryhodné důkazy identity potřebné pro uvolňování šarží a regulatorní audit.
• Řízená částečná digesce a možnost kombinovat pod- i přebytečné digesce zvyšují flexibilitu při analyzování různě strukturovaných mRNA konstrukcí.
• Automatizace a rychlá vizualizace snižují pracovní náklady a čas na analýzu, což je důležité pro škálování výrobních zkoušek a rutinní QC.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další rozvoj automatisovaných MAM-stylů (multi-attribute methods) pro mRNA, zahrnující širší paletu atributů kvality a zpracování dat integrovaným způsobem.
• Zlepšení softwaru pro automatické slučování výsledků z více enzymů, lepší algoritmy pro rozlišení izobarických sekvencí a více intuitivních vizualizačních rozhraní.
• Standardizace postupů a validačních kritérií (ppm okna, prahové hodnoty spolehlivosti, ASR limity), aby byly metody přenositelné mezi QC laboratořemi a akceptovatelné regulátory.
• Rozšíření použití na další oligonukleotidové modality a integrace s genomickými/sekvenačními technologiemi pro komplexní charakterizaci bioterapeutik.

Závěr

Spolupráce mezi Univerzitou v Sheffieldu a Thermo Fisher předvádí funkční, QC-ready blueprint pro mRNA sequence mapping založený na řízené částečné digesci, plné automatizaci a silné softwarové podpoře. Kombinace offline i online přístupů spolu s vizualizačními nástroji umožňuje vysoké unikátní pokrytí (~98 %), rychlé zpracování a reprodukovatelnost vhodnou pro rutinní QA/QC a škálování výroby mRNA terapeutik.

Reference

1. Vanhinsbergh CJ, Criscuolo A, Sutton JN, Murphy K, Williamson AJK, Cook K, Dickman MJ. Characterization and Sequence Mapping of Large RNA and mRNA Therapeutics Using Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 2022;94(20):7339-7349. doi:10.1021/acs.analchem.2c00765.
2. Welbourne EN, Copley RJ, Owen GR, Evans CA, Isoko K, Cook K, Cordiner J, Kis Z, Moghadam PZ, Dickman MJ. Mass spectrometry-based mRNA sequence mapping via complementary RNase digests and bespoke visualisation tools. Analyst. 2025;150(5):1012-1021. doi:10.1039/d5an00033e.