Monitoring monoclonal antibody bioproduction processes with 2D-LC-UV

Monitorování bioprodukce monoklonálních protilátek pomocí 2D-LC-UV — přehled a výsledky aplikace

Význam tématu

Biologické léčivé látky, zejména monoklonální protilátky (mAb), vykazují vysokou složitost způsobenou posttranslačními modifikacemi, agregací a dalšími variantami, které ovlivňují bezpečnost a účinnost produktu. Rychlé, spolehlivé a at‑line analytické metody pro sledování klíčových atributů kvality (PQAs) v průběhu upstream produkce umožňují včasné zásahy a optimalizaci procesu.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem prezentované aplikace bylo vyvinout a demonstrovat přepínatelný heart‑cut 2D‑LC‑UV postup, který v jednom pracovním postupu poskytne: stanovení titru mAb (ProA 1D), separaci nabitostních variant (SCX 2D, cesta a) a analýzu velikostních variant (SCX‑trap → SEC 2D, cesta b). Metody byly optimalizovány na NISTmAb (RM 8671) a aplikovány na skutečné vzorky z dvou paralelních lab‑bioreaktorů produkujících cNISTmAb během 10 dnů.

Použitá metodika a pracovní postup

Krátký popis postupu:

• 1. dimenze (1D): Protein A (MAbPac Protein A) sloužila k selektivnímu vyčištění mAb z HCC (harvested cell culture). Eluce probíhala při nízkém pH; část frakce byla sbírána do 250 µL heart‑cut smyčky (limitovaná na 175 µL pro snížení breakthrough).
• Transfer: heart‑cut frakce byla přenesena do 2. dimenze (2D) přes CutValve.
• 2. dimenze – cesta a (ProA → SCX): krátký ProPac 3R SCX (2 × 50 mm, 3 µm) odděloval nabitostní varianty pomocí lineárního NaCl gradientu při pH ~6,5; UV detekce na 280 nm pro relativní kvantifikaci (relativní plochy / výšky).
• 2. dimenze – cesta b (ProA → SCX trap → SEC): SCX fungoval jako re‑fokační trap, mAb byly eluovány krokem na vysoký NaCl (až ~300 mM) a převedeny do MAbPac SEC‑1 (4 × 300 mm) pro separaci velikostních variant; postup významně zlepšil tvar a rozlišení SEC píku oproti přímému ProA→SEC transferu.
• Řízení a zpracování dat: Chromeleon CDS s funkcí PrepareNextInjection pro překryvnou přípravu injekcí s cílem zkrátit cyklus.

Použitá instrumentace

Klíčové komponenty a konfigurace:

• Vanquish Flex Simple Switch 2D‑LC systém (loop heart‑cut), včetně Quaternary 1D pumpy a Binary 2D pumpy.
• Vanquish Dual Split Sampler (volitelný), heart‑cut smyčka 250 µL (Viper MP35N), kapiláry Viper/MP35N a CutValve/SelectValve pro přepínání cest.
• Kolony: MAbPac Protein A (1D, 4 × 35 mm), ProPac 3R SCX (2 × 50 mm, 3 µm) jako separační i trap kolona, MAbPac SEC‑1 (4 × 300 mm, 5 µm) pro size‑exclusion.
• Detekce: Vanquish Variable Wavelength Detectors (1D i 2D), UV 280 nm, flow cell 2.5 µL.
• Další doplňky: aktivní předohřevy, Viper fractionation loop, Chromeleon 7.3.2 pro řízení a zpracování.

Vzorky a kalibrace

Ke kalibraci a metodickému vývoji sloužil NISTmAb RM 8671; kalibrační křivka pro titer vykazovala vynikající linearitu (R2 ≈ 0,99965). Bioreaktorové HCC vzorky (cNISTmAb) byly odebírány denně po dobu 10 dnů z dvou paralelních kultur, filtrované a uchované při −20 °C. Vstřikované objemy byly v průběhu 10 dnů upravovány (1 000 → 250 µL) tak, aby signály zůstaly v kalibrovatelném rozsahu.

Hlavní výsledky a diskuse

Titer mAb:

• Titer sledovaných kultur rostl z přibližně 15 µg/mL na den 1 až 82 µg/mL na den 10.

Charge varianty (ProA→SCX):

• Bylo možné rozlišit až 6 kyselých a 13 zásaditých variant vedle hlavního píku (M). Relativní plošné a výškové poměry byly použity ke sledování trendů vzhledem k proměnnému injikovanému objemu.
• Obě paralelní dávky vykazovaly velmi shodné trendy pro většinu variant (např. B‑1 stabilně ~10–12 % vůči hlavnímu píku), nicméně u několika variant (např. A‑4, B‑4) byly ve dnech 2–4 patrné dočasné odchylky mezi dávkami, které by při skutečném řízení procesu indikovaly potenciální odchylky ve výrobě.

Velikostní varianty (ProA→SCX trap→SEC):

• Díky re‑fokusu na SCX byly SEC píky úzké a dobře rozlišené; detekován monomer, LMW fragmenty a nejméně dvě HMW frakce (HMW‑1, HMW‑2).
• LMW relativní podíl klesl z ~10 % na stabilních ~4 % během několika dní. HMW‑1 vzrůstal z ~2 % na ~3.5 % v počáteční fázi, poté se objevila HMW‑2, což nasvědčuje změně typu agregátů během procesu.

Robustnost a provozní aspekty:

• Heart‑cut loop omezující přenesený objem (175 µL) snížil průnik a pomohl udržet reprodukovatelnost. Přepínatelný režim umožňuje rychlé přepnutí mezi analýzami bez nutnosti rozsáhlé re‑ekvilibrace.
• ProA→SCX→SEC přístup řeší problém dispersion při přímém ProA→SEC transferu a zlepšuje tvar píků a kvantifikační spolehlivost SEC separace.

Přínosy a praktické využití metody

Hlavní přínosy:

• At‑line monitorování více PQAs (titer, nabitostní varianty, velikostní varianty) z jediné injekce vzorku z HCC bez rozsáhlé předúpravy.
• Rychlé rozhodování během upstream produkce díky UV detekci — vhodné tam, kde HRAM MS poskytuje nadbytečné informace pro operativní kontrolu.
• Flexibilita konfigurace (možnost provozu ProA‑SCX nebo ProA‑SCX‑SEC) dovoluje přizpůsobit analýzu aktuálním potřebám procesu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry rozvoje a aplikace:

• Integrace s hmotnostní spektrometrií (HRAM MS) pro podrobnější charakterizaci modifikací v offline nebo online režimu tam, kde je to vyžadováno.
• Další automatizace a validace pro implementaci ve výrobním prostředí GMP/QA, včetně robustních kontrolních limitů pro klíčové PQAs.
• Rozšíření mD‑LC přístupů zahrnujících in‑line redukci nebo enzymatické štěpení pro rychlé mapování modifikací.
• Zlepšení softwarových pracovních postupů pro automatickou detekci odchylek mezi šaržemi a generování alarmů pro procesní zásahy.

Závěr

Přepínatelný heart‑cut 2D‑LC‑UV postup (ProA‑SCX a ProA‑SCX‑SEC) pro at‑line monitorování mAb produkce prokázal schopnost spolehlivě měřit titer, sledovat komplexní profil nabitostních variant a kvantifikovat velikostní varianty přímo ze vzorků HCC. Metoda kombinuje selektivní očistu v 1D, efektivní zachycení a případné re‑fokusování na SCX v 2D a volitelnou SEC separaci pro agregáty, čímž nabízí praktický a rychlý nástroj pro kontrolu a optimalizaci upstream procesů.

Reference

1. Rathore A. S.; Chakraborty D.; Auclair J. Two‑Dimensional Liquid Chromatography Applications in Biopharmaceutical Analysis. LCGC International 2025, 2(6), 14–21.
2. van den Hurk R. S.; Pursch M.; Stoll D. R.; Pirok B. W. J. Recent Trends in Two‑Dimensional Liquid Chromatography. TrAC Trends Anal. Chem. 2023, 166, 117166.
3. Grübner M.; Schwahn A.; De Pra M. Intact Mass Analysis of Monoclonal Antibody Charge Variants by Multi Heart‑Cut 2D‑LC/MS Coupling Ion‑Exchange and Reversed‑Phase Chromatography. Thermo Fisher Scientific Application Note 001938, 2023.
4. Mayr K.; Weindl T.; Gärtner A.; et al. Novel Multidimensional Liquid Chromatography Workflow with In‑Loop Enzymatic Digests of Multiple Heart‑Cuts. Anal. Chem. 2022.
5. Grübner M.; Scheffler K.; Schwahn A.; et al. Monitoring of Multiple Quality Attributes of Intact Monoclonal Antibodies from Bioreactors by Switchable 2D‑LC‑MS. Thermo Fisher Scientific Application Note 003310, 2024.
6. NISTCHO program information (National Institute of Standards and Technology).