A Trap & Elute Style 2D Protein A–SEC Heart-Cut Method for the Analysis of Monoclonal Antibody Titer and Size Variants in Cell Culture

Význam tématu

Monoklonální protilátky (mAb) jsou klíčové bioterapeutikum s rostoucím využitím v léčbě onemocnění. Monitorování jejich titru a velikostních variant přímo v buněčné kultuře je zásadní pro optimalizaci procesu výroby, zajištění kvality a stability produktu.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem této studie bylo vyvinout jednoduchý a rychlý dvoudimenzionální („heart-cut“) trap-and-elute ProA-SEC postup pro současné stanovení titru mAb a kvantifikaci velikostních variant (HMWS a LMWS) v kondicionovaných médiích CHO buněk.

Použitá metodika a instrumentace

Pro dvě konfigurace byla použita nízkovýtažná affinitní kolona Protein A a následná SEC kolona:

• Vysoké rozlišení (HR): BioResolve ProA 2.1×20 mm (3.5 µm) + ACQUITY Premier SEC 4.6×300 mm (1.7 µm), průtok 0,2 mL/min.
• Vysoký průtok (HT): BioResolve ProA 3.9×5 mm (3.5 µm) + XBridge Premier SEC 7.8×150 mm (2.5 µm), průtok 1,0 mL/min.

Analytický systém: ACQUITY UPLC H-Class s doplňkovým UPLC I-Class čerpadlem, 6port-ventil, TUV detektory (280 nm a 214 nm), Empower CDS. Mobilní fáze pro ProA: fosfátový pufr pH 7.4 (nátěr) a pH 3.0 (eluce). Pro SEC: fosfát-chloridový pufr pH 7.0.

Hlavní výsledky a diskuse

Malé objemy neporézních ProA kolon umožnily přímé načtení eluovaného mAb na SEC sektor, což vedlo ke zvýšené koncentraci špičky, lepšímu rozlišení a rychlé neutralizaci pH. Monomerová recovery překročila 97 %, HMWS recovery se odhadla na 85 %. Metodou indukovaná tvorba HMWS byla menší než 0,2 % (LOQ). Linearita titru byla pro oba postupy vynikající (R2>0,99), LLQ titru ~0,2 µg mAb.

Přínosy a praktické využití metody

• Jednoduché nastavení bez držákových smyček a s jedním ventilem.
• Rychlá HT analýza titru a HMWS do 5 min.
• HR analýza titru, HMWS a LMWS do 20 min.
• Možnost včasné kontroly kvality v reálném čase.

Budoucí trendy a možnosti využití

Metodu lze rozšířit na jiné Fc-obsahující konstrukty, multispecifické protilátky a fúzní proteiny. Perspektivní je integrace s on-line mass spektrometrií, automatizace procesů a nasazení jako součást PAT (process analytical technology) v kontinuální výrobě.

Závěr

Trap-and-elute 2D ProA-SEC heart-cut přístup nabízí robustní a rychlou platformu pro simultánní stanovení titru mAb a velikostních variant v buněčných médiích. Laboratoře by měly ověřit recoveries a metodické artefakty pro vlastní fit-for-purpose aplikace.

Reference

1. Lemmerer M. et al. Journal of Immunological Methods 393(2013):81–85.
2. Gjoka X. et al. Journal of Chromatography B 972(2014):48–52.
3. Dunn Z.D. et al. MAbs 12(1), 2020:1702263.
4. Kizekai L., Shiner S.J., Lauber M.A. Waters Application Note 720007493, 2022.
5. Koza S.M., Yang H., Yu Y.Q. Waters Application Note 720007500, 2022.