Analysis of PROTAC Molecule Bavdegalutamide (ARV-110) Using LC/UV and LC/MS

Význam tématu

Analýza PROTAC sloučenin je klíčová pro vývoj nových léčiv zaměřených na degradační mechanismy proteazomu. PROTAC molekuly jsou bifunkční, synteticky složité a během výroby i skladování mohou vznikat různé nečistoty nebo degradační produkty, které ovlivňují bezpečnost a účinnost. Robustní chromatografické a vysokorozlišovací hmotnostně‑spektrometrické (HR‑MS/MS) postupy jsou nezbytné pro separaci, detekci a strukturální potvrzení těchto přídatných látek a degradantů, což je důležité pro rozhodování v preklinickém a regulačním procesu.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo provést forced degradation testy a komplexní profilování nečistot PROTAC molekuly bavdegalutamidu (ARV‑110) a aplikovat optimalizovanou LC/UV metodu ve spojení s vysokorozlišovací LC/Q‑TOF MS a softwarovou podporou pro strukturální elucidaci. Studie sledovala vhodnost různých chromatografických fází, identifikaci hlavních degradačních a syntézních nečistot a potvrzení struktury hlavního identifikovaného impuritu pomocí MS/MS a Molecular Structure Correlator (MSC) softwaru.

Použitá instrumentace

• LC: Agilent 1290 Infinity II (pumpa, autosampler, termostat, DAD).
• MS: Agilent Revident LC/Q‑TOF (G6575A) s dual AJS ESI.
• Software: Agilent OpenLab CDS 2.8, MassHunter DA/QC (12.x), Molecular Structure Correlator 8.3.
• Hlavní chromatografické kolony testované při vývoji metody: AdvanceBio Peptide Plus (2.1×50 mm, 2.7 µm), Poroshell 120 PFP, Poroshell 120 EC‑C18, Poroshell 120 Aq‑C18 a Poroshell 120 Phenyl‑Hexyl.
• Souhrn důležitých LC parametrů: mobilní fáze 0.1 % kyseliny mravenčí (A) a 0.1 % FA v acetonitrilu (B), gradient 12 min, průtok 0.4 mL/min, teplota kolony 50 °C, injekční objem 0.5 µL (MS), detekce UV při 250 nm.
• Souhrn klíčových MS parametrů: pozitivní ionizace ESI, rozsah m/z 100–1 700, rychlost akvizice 5 spekter/s (MS), fragmentační režim MS/MS s nastavitelnou kolizní energií (energetický vzorec použit), referenční hmota kalibrace, přesnost měření < ±1 ppm pro hlavní ionty.

Použitá metodika

• Příprava vzorku: zásobní roztok ARV‑110 5 mg/mL v DMSO; pro analýzu 1 mg/mL (LC/UV) a 0.5 mg/mL (LC/MS) v 50 % acetonitrilu.
• Forced degradation podmínky: oxidační (10 % H2O2, RT, 3 h), kyselé (1 N HCl, 80 °C, 1 h), zásadité (1 N NaOH, RT, 1 h) a tepelná stress (sucho 70 °C, 3 h).
• Vyhodnocení: komparace chromatogramů na různých stacionárních fázích, vybrání nejlepší kolony na základě rozlišení a počtu detekovaných impurit, následné LC/Q‑TOF MS a MS/MS pro strukturální informaci; použití MSC softwaru k návrhu struktur pro dané fragmentační patterny.

Hlavní výsledky a diskuse

• Výběr kolony: z pěti testovaných fází byla nejvhodnější AdvanceBio Peptide Plus – nabízela nejlepší selektivitu, ostřejší pík, vyšší počet rozlišených impurit a menší šíření pásů. Jiné fáze (PFP, EC‑C18, Aq‑C18, Phenyl‑Hexyl) poskytovaly alternativní selektivity, ale nedosahovaly celkového výkonu Peptide Plus pro profil ARV‑110.
• Forced degradation: oxidační stres vyvolal řadu degradantů (osm detekovaných produktů), přičemž pravděpodobně byly modifikovány skupiny náchylné k oxidaci (např. piperazin, cyklohexylaminy). Tepelný stres nevedl k významným novým produktům, což naznačuje dobrou tepelnou stabilitu v daných podmínkách. Kyselá hydrolýza vytvořila méně produktů než oxidace; alkalická hydrolýza způsobila úplné rozložení hlavní složky s vznikem velmi polárních, časně eluujících produktů.
• LC/Q‑TOF MS: metodika potvrdila molekulovou hmotnost ARV‑110 a ukázala jak jednovrstevnaté, tak dvojnásobně nabité ionty. MS/MS poskytlo charakteristický fragmentační „otisk“, který byl využit k potvrzení identity látky a interpretaci rozkladných produktů. Naměřená přesnost hmotností pro klíčové ionty byla v rozmezí do ±1 ppm, což umožnilo spolehlivou formulaci sumárních molekulových vzorců.
• Identifikace hlavního impuritu: hlavní impurita s m/z 470.1947 byla izolována v EIC a podrobena MS/MS. MSC software vygeneroval návrhy struktur a nejlepší shoda (skóre 97.7) odpovídala struktuře uváděné v literatuře/patentové dokumentaci, čímž byla tato impurita přiřazena s vysokou jistotou. Ostatní neznámé píky lze rovněž zpracovat MSC k návrhu možných vzorců a struktur, přičemž konečné potvrzení může vyžadovat další syntetické nebo NMR studie.

Přínosy a praktické využití metody

• Metoda poskytuje robustní workflow pro separaci a citlivou detekci syntézních a degradačních impurit u PROTAC molekul, což je zásadní pro kontrolu kvality a vývoj farmaceutických forem.
• Kombinace optimalizované chromatografie (volba vhodné kolonové fáze) a HR‑MS/MS výrazně zvyšuje schopnost identifikovat neznámé produkty s vysokou přesností hmotnosti a informacemi ze fragmentace.
• Automatizované nástroje pro interpretaci (MSC) urychlují návrh struktur impurit a zkracují čas potřebný pro řízení rizik spojených s nečistotami během vývoje a regulace.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozvoj a integrace pokročilých algoritmů pro predikci fragmentace a strojového učení mohou dále zrychlit a zpřesnit identifikaci neznámých impurit u složitých molekul, jako jsou PROTACy.
• Vícedimenzionální chromatografie (LC×LC) a ion mobility MS mohou nabídnout zvýšené rozlišení pro blízce příbuzné izomery a stereochemické varianty PROTAC sloučenin.
• Standardizované forced degradation protokoly a databáze degradantů pro PROTAC třídu by usnadnily srovnávání dat mezi laboratořemi a podpořily regulatorní hodnocení.
• Konečná strukturální potvrzení neznámých impurit bude stále vyžadovat komplementární techniky (NMR, syntéza referenčních standardů), obzvlášť pokud je cílem jednoznačné přiřazení struktury pro toxikologické posouzení.

Závěr

Studie ukazuje, že pečlivý výběr chromatografické fáze a použití vysokorozlišovací LC/Q‑TOF MS v kombinaci s nástroji pro strukturální korelaci umožňuje efektivní separaci, rozpoznání a vysokou důvěru v identifikaci hlavních impurit PROTAC sloučeniny ARV‑110. Oxidační a zásadité podmínky generovaly nejvíce degradantů, přičemž hlavní impurita (m/z 470.1947) byla úspěšně navržena a potvrzena pomocí MSC softwaru. Metodika podporuje rozhodování v oblasti výzkumu a vývoje, kontroly jakosti a přípravy regulačních podání pro komplexní terapeutické modality.

Reference

1. Anaya YA, et al. Proteolysis‑Targeting Chimeras in Cancer Therapy: Targeted Protein Degradation for Next‑Generation Treatment. Cancer. 2025;131(21):e70132.
2. Snyder LB, et al. Preclinical Evaluation of Bavdegalutamide (ARV‑110), a Novel PROteolysis TArgeting Chimera Androgen Receptor Degrader. Molecular Cancer Therapeutics. 2025;24(4):511–522.
3. Moreau K, et al. Proteolysis‑Targeting Chimeras in Drug Development: A Safety Perspective. British Journal of Pharmacology. 2020;177(8):1709–1718.
4. ICH Expert Working Group. Quality of Biotechnological Products: Stability Testing of Biotechnological/Biological Products Q5C. ICH Harmonized Tripartite Guideline. 1995.
5. Patent: Methods of Manufacturing a Bifunctional Compound, Ultrapure Forms of the Bifunctional Compound, and Dosage Forms Comprising the Same. US 12,043,612 B2. 2024.