Robust peptide quantitation using the TSQ Certis triple quadrupole mass spectrometer and OptiSpray ion source and cartridges

Robustní kvantifikace peptidů pomocí TSQ Certis a OptiSpray: technická zpráva

Význam tématu

Precizní a reprodukovatelná kvantifikace peptidů je klíčová pro rozvoj proteomiky, identifikaci biomarkerů a vývoj bioterapeutik. Triple-kvadrupólové hmotnostní spektrometry zůstávají standardem pro cílené kvantifikace díky vysoké citlivosti, selektivitě a kvantitativní přesnosti. S rostoucími nároky na průtok vzorků a robustnost metod je důležité mít platformy, které kombinují vysokou přenositelnost iontů, rychlé akvizice a snadnou obsluhu, což usnadní práci v translational research a studiích s velkými kohortami.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem práce bylo demonstrovat kvantitativní výkon nové generace triple-kvadrupólu Thermo Scientific TSQ Certis vybaveného OptiSpray iontovým zdrojem a cartridge kolonkami při cílené analýze peptidů. Studie hodnotila reprodukovatelnost, stabilitu retenčních časů a citlivost pro multiplexní panel 82 peptidů reprezentujících 57 proteinů (včetně >20 uznávaných biomarkerů) v matričce lidské plazmy. Metoda byla navržena pro vysoký průtok (100 vzorků/den) s krátkým běhovým časem 13 minut (trap-and-elute konfigurace).

Použitá metodika a instrumentace

Metodika:

• Panel: 82 stabilně značených (SIL) peptidů spíchaných do 50 ng trávěného lidského plazmatického digestu; 11bodová kalibrace 0–120 fmol on-column (šest replik pro každý bod).
• Chromatografie: Vanquish Neo UHPLC v trap-and-elute režimu s PepMap Neo trap cartridgí (300 μm × 5 mm) a PepMap Neo analytickou cartridge 150 μm × 15 cm; běhový čas 13 min (100 SPD); mobilní fáze A: 0.1% HCOOH ve vodě, B: 0.1% HCOOH v 80% acetonitrilu; průtoky 1.8–2.5 μL/min podle gradientu.
• MS akvizice: cílené SRM (scheduled) s okny 2 minut, až 1 080 přechodů v metodě; adaptivní plánování s automatickým navyšováním dwell časů při nižší hustotě přechodů.
• Software: Xcalibur pro akvizici, Skyline a TraceFinder pro automatizovanou detekci, integraci a vyhodnocení dat.

Použitá instrumentace:

• Thermo Scientific TSQ Certis Triple Quadrupole Mass Spectrometer (rychlá akvizice až 900 SRM/s).
• OptiSpray Ion Source s PepMap Neo 150 μm × 15 cm cartridge s kuželovým emitorem (Cat. No. OS150150PN).
• Vanquish Neo UHPLC System (Thermo Scientific) v trap-and-elute konfiguraci.
• PepMap Neo Trap Cartridge 300 μm × 5 mm (Cat. No. 174500).
• Parametry zdroje: +1800 V (positive ion voltage), sheath gas 10 (arb), sweep gas 0, ion transfer tube 250 °C, cartridge temperature 45 °C.
• Reagencie a standardy: SIL peptidy (New England Peptide), Pierce Peptide Retention Time Calibration Mixture (PRTC), acquity-grade acetonitril, formic acid atd.

Hlavní výsledky a diskuse

Citlivost a linearita:

• Median LLOD cca 0.019 fmol on-column a median LLOQ cca 0.164 fmol; tedy sub-femtomolová citlivost pro většinu peptidů.
• Více než 99% peptidů vykazovalo lineární odezvu s R² > 0.99 přes testované rozsahy kalibrace.

Reprodukovatelnost a počet datových bodů:

• V testu 6 replik při 1.48 fmol SIL měly peaky 8–30 bodů na vrcholu (medián 16), přičemž >96% přechodů mělo >8 bodů/peak, což je nad doporučením pro přesné kvantifikace.
• Průměrné RSD peak area v šesti injekcích bylo 3.2% (rozmezí 0.77–12.9%); >98% peptidů mělo RSD <10% v této krátkodobé reprodukovatelnosti.

Robustnost při dlouhodobém provozu:

• Při 71 po sobě jdoucích injekcích 50 ng plazmatického digestu: většina (≈89%) nativních peptidů měla RSD <10%; medián RSD signálu ~3–7% pro různé skupiny peptidů.
• Retenční časy byly extrémně stabilní: pro 35 klíčových peptidů RT v rozsahu 3.09–10.42 min a RT RSD 0.084–0.56% (průměr ~0.3%); PRTC standardy vykázaly RT RSD <0.5% pro 13/14 peptidů.

Dynamika SRM plánování a produktivita:

• Dwell časy se pohybovaly ~1.3–2 ms; cyklus ~0.4–0.6 s, čímž bylo dosaženo vysoké duty-cycle efektivity pro multiplexované panely při 100 SPD.

Diskuse: Kombinace rychlé elektroniky TSQ Certis a stabilního OptiSpray rozhraní s cartridge kolonkami umožnila vyvážit vysoký počet přechodů a stále udržet dostatečný počet datových bodů a nízké RSD. Výsledky potvrzují vhodnost platformy pro rozsáhlé, cílené studie biomarkerů požadující opakovatelnou kvantifikaci a stabilní chromatografii.

Přínosy a praktické využití metody

Praktické přínosy:

• Vysoká citlivost a linearita umožňují kvantifikace na sub-femtomolární úrovni pro většinu analytů v panelu.
• Vynikající retenční a signální stabilita podporuje plánované SRM metody s úzkými okny, což zvyšuje kapacitu multiplexování.
• Krátké běhové časy (13 min) a robustní cartridge systém zjednodušují obsluhu, snižují downtime a jsou vhodné pro pracovní toky s vysokým průtokem (100 SPD).

Oblasti použití:

• Pre-klinická ověření biomarkerů, translational research projekty, verifikace kandidátních markerů v rozsáhlých kohortách.
• Laboratorní workflowy, kde je požadavek na vysokou reprodukovatelnost mezi dávkami a operátory.

Budoucí trendy a možnosti využití

Možné směry dalšího rozvoje a nasazení:

• Další zvýšení multiplexu při zachování počtu bodů na vrcholu díky optimalizovanému plánování a vylepšeným algoritmům pro řízení dwell časů.
• Integrace s automatizovanými předpřípravnými roboty a online QC pro vyšší throughput a menší lidský zásah.
• Propojování výsledků s pokročilou datovou analýzou (machine learning) pro robustnější normalizace a objevování vzorů v kohortních studiích.
• Standardizace pracovních postupů a mezinárodní validace panelů pro přenositelné translational/klinické aplikace (přestože současné produkty nejsou určeny pro diagnostické použití bez další validace).

Závěr

TSQ Certis v kombinaci s OptiSpray zdrojem a cartridge kolonkami ukazuje vynikající výkon pro cílenou kvantifikaci peptidů: sub-femtomolová citlivost, výborná linearita (>99% peptidů R²>0.99), nízké RSDy signálu a velmi stabilní retenční časy při vysokém průtoku (100 SPD). Platforma poskytuje vyvážené řešení mezi vysokou propustností a analytickou kvalitou, což ji činí vhodnou pro studie biomarkerů, verifikaci kandidátů a translational research s velkými soubory vzorků.

Reference

1. Fu Q.; Remes P.M.; Lee J.; Jacob C.; Li D.; Vegesna M.; Raedschelders K.; Haghani A.; Mengesha E.; Debbas P.; Hoedt E.; Joung S.; Cheng S.; Peterman S.; Fert-Bober J.; Melmed G.Y.; McGovern D.P.B.; Murray C.I.; Van Eyk J.E. Development and clinical evaluation of a multiplexed health surveillance panel using ultra high-throughput PRM-MS in an inflammatory bowel disease cohort. Angew Chem Int Ed Engl. 2025 Nov 10;64(46):e202507610. doi:10.1002/anie.202507610.
2. Fu Q.; Johnson C.; Inker L.A.; Van Eyk J.E. A targeted LC MS/MS assay of a health surveillance panel and its application to chronic kidney disease. bioRxiv [Preprint]. 2025 Mar 16;2025.03.14.643399. doi:10.1101/2025.03.14.643399.