High-throughput proteomics using narrow window DIA on the Orbitrap Astral Zoom mass spectrometer

Význam tématu

nDIA (narrow-window data-independent acquisition) je klíčová metoda pro vysokoprůchodovou (high-throughput) proteomiku, protože kombinuje reprodukovatelnost a kvantitativní přesnost DIA s vyšší selektivitou blízkou DDA. To je zásadní pro rozsáhlé studie (klinické kohorty, chemoproteomika, screening), kde je potřeba dosáhnout hlubokého pokrytí proteomu během velmi krátkých chromatografických běhů. Hlavní výzvou je balanc mezi šířkou izolačních oken, počtem oken (cyklický čas) a dostatečným počtem datových bodů na chromatografickém píku pro spolehlivou kvantifikaci.

Cíle a přehled studie

Cílem technické poznámky bylo zhodnotit výkonnost Thermo Scientific Orbitrap Astral Zoom mass spectrometru pro high-throughput proteomiku se zaměřením na nDIA metody. Autorům šlo o porovnání s předchozí generací Orbitrap Astral MS, posouzení identifikací, kvantitativní přesnosti a přesnosti (accuracy), variability mezi přístroji a demonstraci parametrických strategií (izolační okna, MS2 injekční časy, předakumulace iontů) pro škálu průchodností od 30 do 300 vzorků/den (SPD).

Použitá instrumentace

• Orbitrap Astral Zoom mass spectrometer (detektor Astral, funkce pre-accumulation / bent-trap)
• Vanquish Neo UHPLC systém s EASY-Spray ion source (nano-cap trap & elute konfigurace pro různé SPD)
• Kolony: IonOpticks Aurora Ultimate 25 cm × 75 µm (30 SPD) a Thermo EASY-Spray 150 µm × 150 mm (60–300 SPD) + PepMap Neo trap cartridge
• Standardní digesty: Thermo Pierce HeLa Digest, Promega Yeast digest, Waters MassPREP E. coli digest
• Software: Spectronaut 19.5 (directDIA) pro identifikaci a kvantifikaci
• Hlavní spotřební materiál: LC-MS grade rozpouštědla (FA, ACN, IPA), TFA, 96-well LoBind destičky atd.

Použitá metodika

• Vzorky: série 1) HeLa digest (20–200 ng) a 2) tři-proteomová směs (Homo sapiens : yeast : E. coli) v definovaných poměrech a zatíženích 20 ng–1 µg.
• Průchodnost: metody navrženy pro 30, 60, 100, 180 a 300 SPD s krátkými gradienty; pro 30 SPD použity delší nano-kolony pro hlubší pokrytí.
• DIA schémata: primárně úzká izolační okna 2 Th (380–980 m/z) pro maximální identifikace; v experimentech testována okna 2–5 Th a omezení rozsahu prekurzorů (např. 400–800 m/z) pro zvýšení MS2 DPPP.
• MS parametry: orbitrap full scan @240k; Astral MS² skeny s maximálními injekčními časy 2–10 ms; Astral Zoom umožňuje scany až ~270 Hz (210–270 Hz závisle na IT) a bent-trap pre-accumulation ~1 ms pro zvýšení počtu iontů bez prodloužení cyklu.
• Data processing: Spectronaut 19.5 directDIA, unikátní (stripped) peptidy a normalizace podle lidského FASTA; triplikáty analyzovány společně pro každou zátěž.

Hlavní výsledky a diskuse

• Identifikace: při 30 SPD a 200 ng HeLa bylo dosaženo ~11 117 proteinových skupin a >200 000 unikátních peptidů; při 300 SPD a 200 ng ~8 000 proteinových skupin (~100 000 peptidů).
• Porovnání s Orbitrap Astral MS: Orbitrap Astral Zoom MS vykazoval konstantní nárůst identifikací — zhruba 10–15 % více peptidů/prekursorů a ~5 % více proteinových skupin; při velmi krátkých gradientech byly zisky ještě vyšší (peptidy +15–25 %, proteiny +11–17 %).
• Předakumulace (bent-trap): tento režim přidává ~1 ms efektivního času pro MS² bez nutnosti prodloužit primární IT, což umožňuje dvě strategie: a) snížit deklarovaný MS² IT o 1 ms pro rychlejší cykly (více DPPP), nebo b) přidat pre‑accumulation na již existující IT pro zvýšení citlivosti (více iontů na sken) — volba závisí na zatížení a požadavku na DPPP vs. citlivost.
• Kvantitativní přesnost a přesnost (accuracy): mediánový CV na úrovni proteinových skupin ~4–4.5 % (u obou přístrojů), mediánový CV na úrovni peptidů ~12–13 % (o něco vyšší u Zoom kvůli detekci více nízce abundantních peptidů). Relativní chyby ve stanovených proteomových poměrech v modelových směsích byly <7.5 %.
• Optimální DPPP: pro 100 ng HYE při 30 SPD byl nejlepší kompromis 3 Th / 5 ms (medián DPPP ≈ 4) — maximalizoval identifikace a poskytl nejlepší CV; metody 2 Th/3 ms (DPPP ~3) nebo 5 Th/10 ms (DPPP ~5) vykázaly podobnou přesnost poměrů, ale 5 Th/10 ms vedla ke ztrátě ~500 proteinů a ~20 000 peptidů ve srovnání s 3 Th/5 ms.
• Robustnost a reprodukovatelnost: test na 25 různých Orbitrap Astral Zoom MS během 4 měsíců ukázal variability identifikací proteinových skupin menší než 5 % mezi přístroji.

Přínosy a praktické využití metody

• Orbitrap Astral Zoom MS umožňuje reálné nasazení nDIA v režimech vysoké průchodnosti bez kompromisů v hloubce a kvalitě identifikací — vhodné pro rozsáhlé klinické či screeningové projekty.
• Flexibilita mezi MS1- vs. MS2‑kvantifikací: pro maximální identifikace lze využít ultraúzká okna (2 Th) a MS1 kvantifikaci; pro robustní MS2 kvantifikaci je doporučeno mírné rozšíření oken (3–5 Th) a optimalizace m/z rozsahu pro zvýšení DPPP.
• Vylepšená detekce nízce abundantních proteinů a lepší sekvenční pokrytí díky vyššímu počtu kvalitních MS² spekter bez potřeby spektrálního průměrování.
• Užitečné pro PTM analýzy a lokalizaci modifikovaných míst díky vyšší selektivitě izolace a čistším MS² spektrům.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Dálší optimalizace nDIA pro PTM-specifické workflowy (fosfoproteomika, glykoproteomika) díky vyšší selektivitě a citlivosti.
• Integrace s library-free a strojově učenými přístupy pro rychlejší a robustnější interpretaci složitých nDIA dat.
• Škálování pro rozsáhlé klinické kohorty a kombinace s automatizovanou přípravou vzorků a smart schedulingem instrumentalních zdrojů.
• Možné další zvyšování rychlosti a efektivity skrze pokročilé dekonvoluční algoritmy a další ladění pre‑accumulation režimů.

Závěr

Orbitrap Astral Zoom MS prokázal schopnost posunout hranice high-throughput nDIA proteomiky: výrazně vyšší identifikační výkon, lepší pokrytí nízkých abundancí a zároveň zachování vynikající kvantitativní přesnosti a přesnosti. Přístroj přináší flexibilní možnosti optimalizace mezi citlivostí, počtem datových bodů na píku a cyklickým časem, což jej činí vhodným řešením pro rozsáhlé proteomické studie, kde jsou klíčové jak rychlost, tak datová kvalita.

Reference

• Lou R., Shui W. Acquisition and analysis of DIA-based proteomic data: A Comprehensive survey in 2023. Molecular & Cellular Proteomics 2024;23(2):100712.
• Lancaster N.M., Sinitcyn P., Forny P. et al. Fast and deep phosphoproteome analysis with the Orbitrap Astral mass spectrometer. Nat Commun. 2024;15:7016.
• Jager S., Zeller M., Pashkova A. et al. In-depth plasma N-glycoproteome profiling using narrow-window data-independent acquisition on the Orbitrap Astral mass spectrometer. Nat Commun. 2025;16:2497.
• Guzman U.H., Martinez-Val A., Ye Z. et al. Ultra-fast label-free quantification and comprehensive proteome coverage with narrow-window data-independent acquisition. Nat Biotechnol. 2024;42:1855.
• Serrano L.R., Peters-Clarke T.M., Arrey T.N. et al. The one hour human proteome. Molecular & Cellular Proteomics 2024;23(5):100760.