Rapid High-Throughput Amino Acid Analysis of GLP-1 Analogs

Význam tématu

Glukagon‐like peptid‐1 (GLP-1) analógy získaly významné postavení v léčbě diabetu 2. typu i redukci tělesné hmotnosti. Pro zajištění konzistentní kvality a souladu s regulatorními požadavky je klíčové rychlé a spolehlivé stanovení aminokyselinového složení peptidů. Tradiční hydrolytická a derivatizační šetření mohou zabrat desítky hodin, což omezuje vysokoprůchodní provoz v rámci výroby a kontroly kvality.

Cíle a přehled studie / článku

Tato studie představuje zkrácený workflow pro vysokoprůchodní aminokyselinovou analýzu GLP-1 analógů kombinující:

• mikrovlnné kyselé hydrolytickéo štěpení peptidů do aminokyselin,
• pre‐column derivatizaci pomocí AccQ·Tag Ultra Chemistry Kit,
• rychlou chromatografii na UPLC-UV systému ACQUITY Premier,
• plně automatizované zpracování dat v Empower CDS.

Použitá metodika a instrumentace

Peptid exenatid byl hydrolyzován v 6N HCl mikrovlnným zařízením Discover Prep (CEM Corp.) při 160 °C po dobu 20 minut. Po vyrovnání pH s NaOH bylo hydrolyzát derivatizováno AQC činidlem z AccQ·Tag Ultra Derivatization Kit. Chromatografie proběhla na ACQUITY Premier Binary System s TUV detektorem (λ=260 nm) a kolonkou AccQ·Tag Ultra Column (1.7 μm, 2.1×100 mm) při průtoku 0,7 ml/min, teplotě 45 °C a objemu injekce 1 μl. Optimalizovaný nelineární gradient umožnil separaci všech derivatizovaných aminokyselin do 10 minut.

Použitá instrumentace

• Discover Prep Microwave Hydrolysis System (CEM Corp.)
• Waters ACQUITY Premier Binary UPLC System
• AccQ·Tag Ultra Column 130 Å, 1.7 μm, 2.1×100 mm
• Waters AccQ·Tag Ultra Derivatization Kit
• TUV detektor (λ=260 nm, 10 Hz)
• Empower Chromatography Data System

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizace chromatografického gradientu potvrdila, že nelineární gradient zlepšil rozlišení kritické dvojice serin/arginin během 10 minut bez ztráty dalších aminokyselin. Mikrovlnné štěpení zkrátilo dobu hydrolyzy z běžných 24 hodin na 20 minut při zachování úplného rozkladu peptidu a minimalizaci degradace labilních aminokyselin. Empower CDS umožnil automatické vytvoření kalibračních křivek z triplikátů, výpočet počtu residuí na peptidovou molekulu a okamžité označení výsledků mimo specifikace (např. nadbytečný prolin v jednom vzorku).

Přínosy a praktické využití metody

• Významné zkrácení doby analýzy (z hodin na minuty).
• Vysoká reprodukovatelnost díky prémiovým činidlům a UPLC kolonkám.
• Rychlé rozhodování v QC laboratoři díky integrovanému software s automatickou kontrolou limit.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozvoj online mikrovlnné hydrolyzy integrováné přímo do chromatografického systému, rozšíření aplikace na komplexní směsi peptidů a proteomické analýzy, využití strojového učení pro predikci a interpretaci chromatogramů a kombinace UV detekce s hmotnostní spektrometrií pro zlepšené rozlišení izobarických aminokyselin.

Závěr

Prezentovaný workflow spojující mikrovlnné kyselé hydrolytickéo štěpení, rychlou derivatizaci a UPLC-UV analýzu s automatizovanou správou dat v Empower CDS poskytuje robustní, vysokoprůchodní a snadno ovladatelnou metodu pro QC aminokyselinového složení GLP-1 analógů. Metoda významně urychluje výrobní procesy a zvyšuje spolehlivost kontrol kvality.

Reference

1. Simeone J., Hong P. Instrument Considerations for Successful Adaptation of Amino Acid Analysis Methods. Waters Application Note 720007440, 2021.
2. Martin K., Simeone J., Hong P. Instrument Considerations for Successful Adaptation of Amino Acid Analysis Methods. Waters Application Note 720008073, 2023.
3. Hewitson H., Wheat T.E., Diehl D. Amino Acid Analysis of Pure Protein Hydrolysates. Waters Application Note 720002404, 2007.
4. Yang J., Liu B., Rainville P.D., Harden S. Development of A New Gradient Elution Program for Analysis of Amino Acids. Waters Application Note 720008700, 2025.
5. USP. Biotechnology-derived Articles—Amino Acid Analysis <1052>. USP-NF, Rockville, MD, 2018.
6. USP. Exenatide. USP-NF, Rockville, MD, 2017.
7. Han D., Ippoliti S., Birdsall R.E., Nyholm K. Accelerating Method Development and Manufacturing of GLP-1 Analogs with LC-UV/MS. Waters Application Note 720008800, 2025.