Automated and Assisted Solid-Phase Extraction (SPE) Sample Preparation for Bioanalysis of GLP-1 Analogs from Plasma

Automatizovaná a asistovaná SPE příprava vzorků pro bioanalýzu GLP-1 analogů v plasmě

Význam tématu

Rostoucí využití GLP-1 analogů v léčbě diabetu, obezity a nově také v oblasti neurodegenerativních onemocnění zvyšuje potřebu přesných, citlivých a reprodukovatelných bioanalytických metod. Tyto syntetické peptidy jsou chemicky modifikovány proti enzymatické degradaci, což prodlužuje jejich farmakokinetiku, ale zároveň zvyšuje náchylnost k nespecifickému adsorpci na povrchy a vazbě na plazmatické proteiny. To komplikuje kvantifikaci v komplexních matricích a vyžaduje robustní extrakční postupy s nízkými ztrátami a minimálními matricovými efekty.

Cíle a přehled studie / článku

Hlavním cílem bylo vyvinout a ověřit rychlý, univerzální a vysoce propustný dvoukrokový SPE postup pro extrakci pěti GLP-1 analogů (semaglutid, exenatid, liraglutid, lixisenatid a tirzepatid) z plazmy a ukázat jeho proveditelnost v plně automatizovaném i asistovaném (semi-automatizovaném) režimu. Studie porovnává manuální, Pipette+ asistované a plně automatizované Andrew+ zpracování se zaměřením na výtěžnost, míru matricových efektů, linearitu kalibračních křivek a časovou úsporu při zpracování souborů vzorků.

Použitá metodika a instrumentace

Popis postupu:

• Vzorek: 200 µL Sprague Dawley potkaní plazmy navozené standardy GLP-1 analogů.
• Předúprava: precipitace přidáním 200 µL studeného kyselého acetonitrilu, následné odloučení supernatantu centrifugací.
• Ředění: supernatant naředěn 400 µL kyselou vodou a aplikován na Oasis PRiME HLB µElution 96-well destičku.
• Eluce: dvakrát 25 µL 3 % amoniaku v 75 % acetonitrilu; eluáty 1:1 naředěny vodou a přímo injikovány do LC-MS/MS.
• Výhoda µElution formátu: eliminace kroku odpaření/rekonstituce, kde dochází k častým ztrátám peptidů.

Použitá instrumentace:

• Automatizace a software: Andrew+ Robot, Pipette+ Smart Pipette, Extraction+ a OneLab Software pro řízení a stopu (audit trail).
• SPE sorbent a sběrné destičky: Oasis PRiME HLB µElution Plates; QuanRecovery Collection Plates s MaxPeak High Performance Surfaces pro redukci nespecifické adsorpce (NSB).
• LC systém: ACQUITY Premier System s Flow‑Through Needle (FTN) a kolona ACQUITY Premier Peptide CSH C18, 130 Å, 1.7 µm, 2.1 x 50 mm; teplota kolony 65 °C; objem injekce 10 µL.
• MS systém: Xevo TQ Absolute (ESI+), MassLynx a TargetLynx software; uvedeny provozní parametry (např. kapilární napětí 2.00 kV, desolvace 500 °C apod.).
• Doplňková praxe: použití Protein LoBind trubic pro skladování zásob a vzorků ke snížení ztrát.

Hlavní výsledky a diskuse

Klíčové nálezy:

• Metoda dosáhla reprodukovatelných výtěžností pro všech pět GLP-1 analogů při zpracování potkaní plazmy.
• Matricové efekty byly u všech analyzovaných látek nízké (<20 %), což indikuje účinné odstranění interferencí, včetně fosfolipidů.
• Kalibrační křivky vykazovaly linearitu v rozsahu 5–1000 ng/mL s R2 > 0,99 pro obě automatizované i asistované pracovní postupy.
• Časová efektivita: zpracování 48 vzorků trvalo manuálně ~3 h 30 min, plně automatizovaně Andrew+ ~2 h 1 min (úspora ~42 %) a asistovaně Pipette+ ~1 h 36 min (úspora ~54 %). Pipette+ byl nejrychlejší, protože lidský operátor zvládl některé kroky rychleji než robotická ruka.

Diskuse poznámek k implementaci:

• Oasis PRiME HLB v µElution formátu umožnil krátký dvoukrokový SPE postup bez odpařování, čímž se minimalizovaly ztráty „lepkavých“ peptidů.
• QuanRecovery collection plates a MaxPeak HPS výrazně snížily NSB a tím zlepšily analytickou citlivost.
• Hlavní provozní problém při plné automatizaci byl spojen s odpařováním eluačního rozpouštědla během fáze eluce; jeho kontrola teploty je kritická pro reprodukovatelnost.

Přínosy a praktické využití metody

Praktické výhody:

• Rychlé a univerzální řešení pro současné kvantifikace více GLP-1 analogů v biologických matricích (vhodné pro PK, toxicitu, monitorování léčiv a výzkum).
• Vysoká reprodukovatelnost a nízké matricové efekty zvyšují spolehlivost dat v regulačním prostředí.
• Automatizace (Andrew+) i asistovaná řešení (Pipette+) umožňují zrychlení zpracování, konsistentní výsledky a plnou elektronickou evidenci pomocí OneLab, což zlepšuje compliance a auditovatelnost.
• Eliminace kroku odpařování v µElution formátu snižuje riziko ztráty peptidů a zjednodušuje pracovní postupy v rutině QA/QC a výzkumných laboratořích.

Budoucí trendy a možnosti využití

Směry dalšího rozvoje:

• Integrace teplotně řízených modulů (např. Peltier+ device) do automatizovaných platforem k redukci odpařování eluačních rozpouštědel a zvýšení robustnosti při nízkých objemech eluce.
• Rozšíření validace na humánní plasmě a dalších maticích, včetně dlouhodobých stability a meziprovozní přenositelnosti mezi laboratořemi.
• Optimalizace pro nižší limity detekce a rozšíření na další peptidové terapeutika se silnou tendencí k NSB.
• Větší adopce modulární automatizace a digitálních pracovních postupů ve farmaceutickém vývoji a klinických laboratořích pro zrychlení PK/PD studií.

Závěr

Studie prokázala, že kombinace Oasis PRiME HLB µElution SPE, QuanRecovery sběrných destiček a řízené automatizace (Andrew+ nebo asistovaně Pipette+) poskytuje rychlou, reprodukovatelnou a citlivou metodu pro kvantifikaci GLP-1 analogů v plasmě. Metoda snižuje ztráty způsobené NSB, minimalizuje matricové efekty a výrazně zkracuje čas přípravy vzorků, přičemž zachovává plnou stopovatelnost pomocí OneLab softwaru. Identifikovaným problémem je řízení odpařování eluačního rozpouštědla v automatizovaných úlohách, které je možné řešit řízenou teplotní modulací.

Reference

1. Trudeau M., Scumaci A. SPE-LC/MS Bioanalytical Quantification of the Biotherapeutic Peptide, Semaglutide from Plasma. Waters Application Note; 2023. (Waters Application Note: 720008097)
2. Trudeau M., Lauber M.A. Improved GLP-1 Receptor Agonist Peptide Recovery Using a QuanRecovery with MaxPeak High Performance Surfaces (HPS) Collection Plate. Waters Application Note; 2025. (Waters Application Note: 720008717)